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研究背景:高脂血症是动脉粥样硬化、骨质疏松、高血压、冠心病、脑卒中等疾病发生、发展的重要危险因素,是目前影响人民群众身体健康的高发疾病之一。研究表明高脂血症对骨愈合、骨矿化、骨密度等诸多骨代谢过程有不良影响,高脂血症是引起骨质疏松的危险因素之一。在骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal stem cells,BMSCs)向成骨细胞定向分化中Wnt信号通路起关键性作用。而最近几年大量的研究表明,成骨的分化过程中微小RNA(microRNAs,miRNAs)发挥了重要的生物学功能,例如维持骨代谢的平衡。本课题组前期实验证实高脂饲料喂养的大鼠种植体周围骨质疏松,骨小梁稀疏,排列紊乱;高脂饲料喂养的大鼠种植体周围Ca/P原子个数百分比低于普通饲料喂养的大鼠;荧光定量PCR和Western blot结果显示Dvl2基因、Dvl2蛋白的表达受到抑制,表明高脂血症在一定程度上干扰高脂血症大鼠种植体的早期骨结合。Wnt/β-catenin信号通路中的Dvl2在高脂血症患者中具体如何发挥作用值得探讨。Wnt信号通路与miRNAs存在大量的交叉信号分子,其作用靶点与具体作用机制都值得深入探讨研究。实验目的:(1)观察高脂环境下大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)成骨分化过程中Runx2、ALP、SP7、PPAR-γ、Dvl2及靶向调控Dvl2相关microRNAs的mRNA表达。(2)利用靶基因预测软件、双荧光素酶报告基因筛选及鉴定出靶向调节Dvl2的microRNAs。(3)探讨microRNAs靶向调节Dvl2对BMSCs成骨分化的影响。实验方法:(1)大鼠骨髓间充质干细胞获取传代培养,培养第三代时行流式细胞检测,分别成骨成脂诱导28天后茜素红和油红O染色,观察成骨成脂分化能力,鉴定BMSCs,以便用于后续实验。用高脂培养基和普通培养基成骨诱导BMSCs诱导28天时分别行茜素红和油红O染色观察成骨分化情况,诱导3、5、7、14、21天,利用RT-PCR检测细胞内成骨相关基因Runx2、ALP、SP7,成脂相关基因PPAR-γ,Wnt信号通路中Dvl2,与靶向调控Dvl2相关的miR-21-5p、miR-29c-3p、miR-138-5p、miR-351-5pmRNA的表达。(2)靶向调控Dvl2相关的microRNAs采用靶基因预测软件Target Scan、MicroRNA.org、miRDB、Microcosm Targets 等四种 miRNA 数据库在线分析软件进行生物信息学预测,以及文献查询,得到可能与Dvl2基因3’UTR区作用的 miRNAs 为:miR-21-5p、miR-29c-3p、miR-138-5p、miR-351-5p。通过体外转染不同浓度(10nm、30nm、50nm、100nm)梯度的FAM-siRNA,6h后镜下观察转染效率和CCK8检测其细胞增殖筛选合适的转染浓度。利用筛选浓度体外转染 miR-21-5p、miR-29c-3p、miR-138-5p、miR-351-5p 的模拟物(mimics)和抑制物(inhibitor),48h后利用RT-PCR检测转染效率,实现Dvl2的过表达和低表达,Western blot检测BMSCs中Dvl2的表达差异,找出引起Dvl2变化最明显的miRNA。构建双荧光素酶报告基因质粒载体,分别用 miR-21-5p、miR-29c-3p、miR-138-5p、miR-351-5p 的模拟物与质粒载体共转293t细胞,利用多功能酶标仪检测荧光素酶活性,验证miRNAs与Dvl2的靶向调控作用。(3)高脂环境下体外转染miR-29c-3p mimics和inhibitor后成骨诱导BMSCs 3、7天,利用Western bolt检测成骨相关基因Runx2、ALP的表达情况。实验结果:(1)流式细胞仪检测结果显示:第三代BMSCs CD44阳性细胞比率是96.7%,CD45阳性细胞比率是2.8%,CD90阳性细胞比率是95.9%。间充质干细胞表面标志抗原表达阳性,验证此细胞为BMSCs,纯度较高。成骨诱导28天茜素红染色、油红O染色结果显示BMSCs具有向成骨成脂方向分化能力。培养28天茜素红染色见高脂组较对照组钙化结节少,油红O染色串珠样脂滴高脂组多于对照组,RT-PCR结果显示成骨指标Runx2、SP7、ALPmRNA表达高脂组较对照组低,成脂指标PPAR-γ mRNA表达高脂组较对照组高,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-21-5p、miR-29c-3p高脂组较对照组均降低,在3、5、7、14天时miR-138-5pmRNA表达量对照组与高脂组无明显差异,在21天时miR-138-5pmRNA表达量对照组明显高于高脂组,差异有显著意义(P<0.05)。在3、5、7天时miR-351-5pmRNA表达量对照组与高脂组无明显差异,在14、21天时miR-351-5pmRNA表达量对照组低于高脂组,差异有显著意义。(2)荧光显微镜观察浓度越高转染效率越高,CCK8浓度越高细胞增殖越受到抑制,Real-time PCR 结果显示,转染 miR-21-5p、miR-29c-3p、miR-138-5p、miR-351-5p的mimics后,与对照组相比其表达量分别升高5-6倍、4倍、1000倍和800倍左右。而转染相应的inhibitor后,与对照组相比其表达量分别降低约3倍、10倍、10倍和5倍。转染miR-21-5p、miR-29c-3p、miR-138-5p、miR-351-5p 的 mimics 和 inhibitor 及 NC48h 后,RT-PCR 结果显示,转染 miR-21-5p 和 miR-29c-3p mimics 后,与 mimics nc 组相比 Dvl2的表达降低,转染 miR-138-5p 和 miR-351-5p mimics 后,与 mimics nc 组相比 Dvl2 的表达升高。转染 miR-21-5p、miR-29c-3p、miR-138-5p、miR-351-5p inhibitor后与inhibitor nc组相比Dvl2的表达都有不同程度的升高。Western blot结果显示,miR-29c-3pmimics/inhibitor转染细胞后,Dvl2表达差异最明显。(3)Western blot 结果显示转染 miR-29c-3p mimics 后 Runx2 和 ALP 的蛋白表达水平均明显比mimics NC组增高,转染inhibitor后Runx2和ALP的蛋白表达水平均明显比inhibitor NC组降低。结论:(1)高脂环境下BMSCs向成骨细胞分化减少,miR-21-5p、miR-29c-3p、miR-138-5p、miR-351-5p参与调控高脂环境下骨代谢和成骨细胞的生物学活性。(2)经双荧光素酶报告基因筛选及鉴定出靶向调节Dvl2的miRNA是miR-29c-3p,而miR-21-5p、miR-138-5p、miR-351-5p对Dvl2的负性调节作用弱。(3)miR-29c-3p通过靶向调节Dvl2间接促进BMSCs向成骨分化、矿化能力。