脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON),又称呕吐毒素,是最常见的一类镰刀菌毒素,广泛存在于燕麦、玉米、小麦、大麦等谷类作物中。DON化学性质稳定,在高温、强酸下也依然能保留毒性,其污染的食物严重威胁人类与动物的健康。高剂量的DON会引起机体发病率与死亡率的升高;低剂量的DON会使其肠道健康受损,免疫机能下降。猪对DON污染极为敏感,即使是极低量的DON,猪在采食后也会出现不良反应、厌食等症状。为了更好地理解DON细胞毒性的分子机理,本研究以猪小肠上皮细胞系IPEC-J2为模型,首先比较了不同浓度DON培养不同时间之后IPEC-J2细胞的活性,选取细胞活性降低明显的一组,作为DON处理IPEC-J2细胞适宜样本进行后续实验。其次,利用RRBS和RNA-seq技术检测了 DON处理后IPEC-J2全基因组DNA甲基化和基因表达的变化。最后,整合分析DNA甲基化和基因表达变化,筛选关键基因。主要实验结果如下:1.通过体外培养实验,比较不同浓度(0、300、500、1000、2000、2500和3000ng/mL)DON处理的IPEC-J2细胞在不同培养时间(24、48、72 h)下细胞活性的变化情况。根据细胞毒性-免疫检测,按照[(实验孔吸光度-空白孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)]X 100%的公式计算出细胞活性。结果表明,IPEC-J2细胞活性随DON浓度的升高和培养时间的延长而逐渐降低,其中1000 ng/mL DON培养48 h组的IPEC-J2细胞活性降低最为明显。2.将经由体外培养得到的DON处理IPEC-J2细胞适宜条件的一组作为样本,对其进行转录组测序,DON处理组和对照组每组4个重复共获得609.3 millionrawreads,在对这些数据进行质控筛选后,共得到597.2 million clean reads,平均每个样本74.6 million clean reads。将得到的clean reads与猪参考基因组对比分析,有552 million reads可比对到参考基因组上,其中528.6 million reads在参考序列上具有唯一位置。对DON处理组与对照组基因差异表达分析,筛选出3226个差异表达基因(Adjusted P<0.05、|log2 fold change|>1.5),其中DON处理组1004个基因上调,2222个基因下调。功能富集分析发现,与缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的降解、细胞色素P450介导的药物代谢、谷胱甘肽的代谢等通路显著相关的基因表达下调;而表达上调的基因显著富集在核糖体合成、mRNA监测通路、RNA转运、TNF信号通路等通路中。3.将经由体外培养得到的DON处理IPEC-J2细胞适宜条件的一组作为样本,对其进行DNA甲基化测序。通过对数据进行质控筛选,DON处理组与对照组每组4个重复平均每个样本38.5 million reads。将得到的clean reads与猪参考基因组对比分析,平均67.4%的clean reads可以对比到猪参考基因组上。构建DON处理IPEC-J2细胞的全基因组甲基化图谱,通过对DON处理组与对照组CpG位点甲基化水平的分布进行分析,发现整体呈现出双峰分布。对DNA甲基化主成分进行分析,发现DON处理组与对照组呈现两个明显分离的集群。对不同基因元件的DNA甲基化水平进行分析,发现启动子区和5’UTR区的甲基化水平低于其他功能区的甲基化水平,转录起始位点附近甲基化水平显著降低,基因体甲基化水平显著升高。通过差异甲基化分析,筛选出3030个DMR,其中2093个DMR在DON处理组显著高甲基化,937个DMR显著低甲基化。整合分析DNA甲基化和转录组测序数据,发现29个基因在启动子区的甲基化与其表达呈负相关,其中包括ASAP3、ST3GAL5和SLC4A11等对细胞生长和增殖具有重要调控作用的基因。上述结果表明,DNA甲基化和表达水平的变化暗示相关基因可能参与DON细胞毒性反应。本研究从表观遗传学角度为理解DON发挥其细胞毒性的分子机制提供了新的见解,在全基因组水平揭示了 DON诱导猪小肠上皮细胞基因表达模式的变化,研究结果可为鉴定DON毒性相关分子标记以及制定相应的防控策略提供理论依据。