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目的:旨在从体内外两个角度探讨人神经干细胞(hNSC)移植联合氨基甲酰化促红细胞化成素(Carbamvlated Erythropoiet iN,CEPO)在新生鼠脑缺氧缺血性脑损伤中的作用。
方法:体外试验:原代培养9-12周人类流产胎儿神经干细胞,利用体外炎症因子刺激模型、氧糖剥夺模型,观察CEPO的抗凋亡及促进神经元分化作用,以及对神经干细胞主要组织相容性抗原(MHC)的影响,同时进行不同信号途径的封闭实验,探讨CEPO发挥作用的分子机制。体内实验:通过建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型(Hypoxic ischemic brain damage,HIBD),在不同的时间点给予CEPO腹腔注射和神经干细胞移植,应用ELISA、Western blot、流式细胞术与免疫组织化学技术等对神经于细胞移植后的分化、凋亡情况,炎症分子、免疫分子在移植前后的改变,以及大鼠神经系统功能检测等各项指标的评估,并与单神经干细胞移植、CEPO腹腔注射效果进行比较,探讨CEPO与神经干细胞应用的最佳厅式与时间窗,以及二者在体内发挥作用的可能信号通路。
结果:成功培养入神经干细胞。在体外炎症分子IFN-Y刺激下,MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达主调,而加入CEPO预处理后,MHC-Ⅰ含量无明显变化而MHC-Ⅱ的水平下降,同时以促进神经干细胞向神经元分化以及神经元轴突的生长;在氧糖剥夺环境中,神经干细胞的凋亡率增加,CEPO可以明显减少细胞凋亡,增加细胞存活率。在新生大鼠HIBO模型,ELISA结果显示缺氧缺血后,患鼠血清中IF-γ和 lL-β均增高,给予CEPO后:二者均明显下降。同时,流式细胞术;最示移植后宿主脑组织ⅦIC-Ⅰ和MtlC-Ⅱ的表达上调,CEPO可以抑制受体大鼠脑组织MHC 的表达。供体神经干细胞24h移植组MIIC-Ⅰ和MHC- Ⅱ的水平高于72h移植组,CEPO与神经干细胞移植联合时,移植细胞MHC的表达下降。另外,CEPO腹腔注射和神经1.细胞移植联合应用可以明湿加快模型鼠神经运动功能的恢复,提高移机神经干细胞的仔活率及神经元的分化率。Western blot法证实应用CEPO后.Jak/Stat信号通路和PI3K、Akt途径均被激活,给予Jak/Stat通路阻断剂后CEPO对MHC分子的调节作用被阻断,给予PI3K/Akt阻断剂后CEPO的抗调亡作用消失,而JaK/Akt途径同时被m断后CEPO对神经元的作用明显减弱。
结论:1、CEPO在正常培养条件F对神经干细胞的分化没有明显影响。但在IFN-γ存在的条件卜,CEPO可促进神经干细胞向神经元分化,并增加神经元轴突的长度。另外,CEPO还可调控神经干细胞中MHC的表达,发挥免疫调节作用。2、CEPO可降低在氧糖剥夺条件下培养的神经干细胞的凋亡率,提高细胞生存率。3、在新生大鼠缺氙缺血脑损伤模型中联合应用CEPO和神经干细胞移植可使移植细胞存活率提高并向神经无分化,降低血中IFN-Y和IL-I B水平,调节供、受体MllC抗原的表达以减少免疫损伤,进而明显改善大鼠的神经运动功能。4、CEPO通过.Jak/Stat和PI3K/Akt信号途径发挥对神经元的作用,通过PI3K/Akt信号通路减少神经干细胞的凋亡,而对MHC的调节作用涉及.Jak/Stat途径。