研究背景:间充质干细胞(MSCs),多呈长梭形,能粘附在塑料表面并形成克隆集落。利用MSCs的增殖分化和再生能力,选择合适的生物材料或细胞因子,可以引导其向神经、骨、软骨等方向的细胞分化,协助参与修复过程。因而,MSCs被广泛认同为组织工程再生的种子细胞。尤其是最早从骨髓内分离出来的骨髓间充质干细胞(BMSCs),性能突出,是该方面的研究热点。近年来研究发现,BMSCs具有免疫调控能力,能够调节局部免疫微环境,提供适合再生的条件。随着对损伤修复过程中免疫反应认识的逐步深入,巨噬细胞作为一种通过调节自身表型参与整个修复过程的免疫细胞,吸引了越来越广泛的关注。BMSCs能够将巨噬细胞(Mφs)诱导为抗炎、促修复的M2表型,进一步促进修复过程的进展。利用不断发展的细胞生物学和细胞治疗技术,BMSCs的免疫调控能力为治疗各种损伤修复及免疫相关疾病带来新的希望。然而,BMSCs的性能受到供体年龄的影响,随着年龄增长,BMSCs增殖、分化、血管形成等性能(体内和体外)随之下降,呈现出衰老状态,极大地影响了其临床应用。另外,往往是老年患者对干细胞治疗的需求最为迫切,因此,年龄是否影响BMSCs的免疫调控能力是将其应用到临床前亟待解决的问题。本课题针对BMSCs和Mφs的性能特点,探讨年龄因素改变对BMSCs调控Mφs表型和功能的影响,为干细胞临床应用提供理论和实验支持。本课题主要包括以下的三个部分内容:1.巨噬细胞及不同年龄小鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定【目的】本部分实验的目的一是稳定培养Mφs系RAW264.7并鉴定;二是分离、培养年轻和年老小鼠来源BMSCs,并对两种细胞的形态、增殖能力、成骨和成脂分化能力进行对比分析,为后续实验奠定基础。【方法】培养扩增RAW264.7,稳定细胞状态,并用流式细胞学检测巨噬细胞标记物(CD11b和F4/80)表达情况。分离BMSCs,显微镜下观察其细胞形态;CCK-8和EdU检测对比细胞增殖能力;茜素红染色和油红-O染色分别比较细胞体外骨向和脂向分化能力。【结果】稳定培养并扩增RAW264.7,培养扩增的RAW264.7高表达巨噬细胞相关标记物。成功分离并培养年轻和年老小鼠来源BMSCs。相比于年老小鼠来源BMSCs(AMSCs),年轻小鼠来源BMSCs(YMSCs)的细胞增殖速度更快并在成骨诱导后产生了更多的钙化小结;成脂诱导后,AMSCs的油红-O阳性细胞数量显著比YMSCs多。【结论】RAW264.7扩增稳定,可用于共培养及后续实验。体外成功分离了小鼠来源BMSCs,且YMSCs的增殖及成骨分化能力更强;AMSCs的成脂分化能力更强。2.骨髓间充质干细胞与巨噬细胞共培养体系的建立【目的】Transwell小室间接共培养RAW264.7与不同年龄BMSCs(包括IFN-γ预刺激的以及未预刺激的),收集共培养处理后的RAW264.7用于后续检测。【方法】将预刺激(IFN-γ预处理12小时)或未预刺激的BMSCs与RAW264.7分别接种于Transwell上下室孵育贴壁过夜,随后再组合为间接共培养体系,共培养48小时。【结果】成功构建两种细胞体外间接共培养的Transwell系统。3.不同年龄骨髓间充质干细胞共培养对巨噬细胞表型和功能的影响【目的】对共培养处理后的RAW264.7进行表型及相关能力的检测和分析。【方法】流式细胞学检测并分析共培养处理后RAW264.7表型相关细胞标记物;qPCR检测细胞因子或巨噬细胞表型相关标记物的基因表达;ELISA检测该细胞分泌细胞因子TNF-α和IL-10的能力;Griess法检测该细胞分泌NO的能力;细胞吞噬实验和Transwell迁移实验检测巨噬细胞的吞噬和迁移能力。【结果】与YMSCs或AMSCs(预刺激或非预刺激)的共培养均能促进RAW264.7表达M2表型相关标记物及分泌抗炎细胞因子,但YMSCs调控RAW264.7的能力更强。共培养后RAW264.7的吞噬能力并未表现出统计学差异;YMSCs或AMSCs(预刺激或非预刺激)的共培养均促进RAW264.7迁移,且预刺激AMSCs促进RAW264.7迁移能力更强。【结论】BMSCs共培养调控Mφs各方面性能向M2表型转变;YMSCs和AMSCs均具有一定免疫调控能力,且YMSCs调控Mφs能力更强;IFN-γ的预刺激影响BMSCs调控Mφs能力,但是这样的预刺激的具体机制及作用大小有待进一步的研究。综上所述,YMSCs和AMSCs均具有一定的调控Mφs的能力,且YMSCs的调控能力更强;IFN-γ对BMSCs调控Mφs具有一定作用,然而是否可以作为干细胞性能调控的方式还有待进一步研究。基于以上研究,我们认为随着年龄增长,干细胞的性能下降可能部分与干细胞免疫调控能力下降有关。探索年龄影响下干细胞性能下降的相关机制和干细胞性能提升的方法对优化完善干细胞治疗和促进干细胞免疫调控的临床转化奠定了理论和实验基础。