研究背景最新的《美国癌症数据报告》显示,不论性别,肺癌均排在癌症死因的首位,且5年生存期率仅18%;随着科技的发展,基因筛查和检测大大提高了包括肺癌靶向治疗、免疫疗法在内的治疗效果,再次突显了探明疾病发生发展过程中潜在的分子机制的重要性。长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）研究不断证实lncRNA是重要的基因调节因子,而现阶段对H19,Xist,MALAT1,HOTAIR等lncRNA的研究是相对透彻的,展示了它们复杂的调控模式。LncRNA还参与了吸烟致癌、表观遗传学调节等过程,例如:有学者系统地研究了在烟草提取物（CSE）诱导16HBE细胞恶性转化过程中lncRNA的功能和表观调节机制,我们也对lncRNA在吸烟致肺癌过程中的作用非常感兴趣。Lnc-BMP1-1最邻近BMP1基因,BMP1基因被揭示与胃癌有关;实际上,lnc-BMP1-1位于SFTPC基因的内含子区域,定位于染色体8p21.3,且SFTPC基因在人肺组织中表达量最高;SFTPC编码与呼吸系统相关的表面活性蛋白SPC（pulmonary surfactant-associated protein C）,SPC是一种极度疏水的表面活性蛋白,仅由Ⅱ型肺泡细胞（typeⅡalveolar cell,AEC）分泌,用于降低肺泡表面张力,防止肺萎缩,对初生婴儿的肺功能和内稳态有重要作用;已有研究揭示SFTPC基因的突变与家系或散发的间质性肺病有关,还被证实在肺癌病人中表达下降。此外,SFTPC被报道与小凹蛋白1（Caveolin-1,Cav-1）有关,各种肺损伤中常见SPC蛋白的表达水平下降及AEC细胞凋亡,通过抑制AEC中p53的表达证实SPC蛋白的缺失和Cav-1蛋白的磷酸化、Src激酶介导的信号通路及AEC凋亡有关,但吸烟并不能引起SPC蛋白的表达下降,提示吸烟致癌途径中可能没有SPC蛋白的直接参与,但SFTPC内含子区域转录的lnc-BMP1-1却可能参与。Cav-1是应对吸烟引起的氧化应激中有重要的膜蛋白,还被揭示受表观遗传调控,例如:低组蛋白乙酰化水平和（或）启动子区的高甲基化水平可能抑制Cav-1的转录;Cav-1是与癌症防治、化疗药敏性相关的候选抑癌基因,但鲜见吸烟致癌过程中Cav-1和lncRNA的关系研究。ATP结合盒A家族成分3（ATP-binding cassette sub-family A member 3,ABCA3）基因和SFTPC基因类似,与婴儿期肺部疾病相关,在肺组织中高表达,二者之间也有关联报道。肺腺癌占肺癌的50%以上,有研究表明Ⅱ型肺泡细胞能够被诱导成为腺癌细胞,A549、GLC82、PC9均是有代表性的肺腺癌细胞。表观遗传学调控是传统基因调控的重要补充,DNA甲基化和组蛋白乙酰化是其中两个重要的调节方式。科学假设肺癌相关的SFTPC基因的内含子区域转录产生的lnc-BMP1-1可能与肺癌的发生发展有关,我们假设lnc-BMP1-1在肺癌的发生发展中有功能,而吸烟过程中的有毒化学物质可能使lnc-BMP1-1表达改变,并影响下游靶基因的表观遗传学调节,从而影响肺癌的发生发展。目的结合lnc-BMP1-1的表达水平和肺癌患者的临床特征、细胞的体内外实验,分析lnc-BMP1-1在肺癌发生发展中的功能、机制及影响其表达的因素。材料和方法（一）分析lnc-BMP1-1在肺癌人群中的表达1.通过实时荧光定量PCR检测276例肺癌组织标本及癌旁正常组织中lnc-BMP1-1的相对表达量。2.统计方法。用t检验分析基因在肺癌组织及其对应癌旁正常肺组织中的表达差异情况;采用χ²检验和Logistic回归模型分析lnc-BMP1-1的表达水平与肺癌患者临床特征及临床进展的关联。（二）Lnc-BMP1-1在肺腺癌细胞中的功能1.构建lnc-BMP1-1过表达细胞。将包含lnc-BMP1-1序列的慢病毒载体导入肺腺癌细胞A549、GLC82和PC9中,构建包括空载体对照细胞在内的三对细胞:A549-BMP和A549-NC,GLC82-BMP和GLC82-NC,PC9-BMP和PC9-NC。2.CCK-8细胞增殖实验、细胞划痕实验、Trans well迁移实验以及Western blot结果分析了稳转细胞的恶性表型。（三）查找lnc-BMP1-1潜在的靶基因结合文献查阅和生物信息学分析,选择lnc-BMP1-1潜在的靶基因,利用qRT-PCR检测它们在肺癌人群中的表达量,观察共表达关系。通过临床特征分析得出lnc-BMP1-1和患者吸烟史有关,考虑香烟烟雾溶解物可能会影响lnc-BMP1-1和下游靶基因的表达。应用香烟烟雾溶解物处理正常支气管上皮细胞（16HBE）,利用qRT-PCR检测lnc-BMP1-1和靶基因的表达情况。（四）裸鼠成瘤试验通过动物体内实验“裸鼠皮下成瘤”进一步验证过表达的lnc-BMP1-1的功能。（五）Lnc-BMP1-1对靶基因的调节机制1.通过甲基化抑制剂（5-AZA）和去乙酰化酶抑制剂（TSA）判断DNA甲基化修饰和组蛋白乙酰化修饰通路对肺腺癌细胞lnc-BMP1-1、靶基因及相关分子的影响。2.检测靶基因启动子区CpG岛的DNA甲基化水平和组蛋白乙酰化水平的变化,综合判断lnc-BMP1-1对靶基因的表观调节机制。（六）药敏实验基于lnc-BMP1-1和肿瘤转移有关,应用A549-BMP细胞进行顺铂（cis-platinum,DDP）和盐酸多柔比星（Doxorubicin hydrochloride,DOX）药敏实验。结果（一）Lnc-BMP1-1在人群中的表达情况1.与癌旁正常组织相比,lnc-BMP1-1在83.33%（230/276）的肺癌患者癌组织中低表达（P<0.001）,仅16.67%（46/276）的患者癌组织中高表达(肺癌标本中P25=0.019,P50=0.044,P75=0.493,癌旁标本中P25=0.225,P50=0.977,P75=2.222,P=8.514×10^-7)。2.Lnc-BMP1-1与患者的吸烟史有明显相关性（P=0.048）。3.Lnc-BMP1-1的低表达与临床进展有关（I+II vs.III+IV,P=0.025）;与肿瘤远端转移有关（M0 vs.M1,P=0.002）。（二）Lnc-BMP1-1在肺腺癌细胞中的功能1.与对照细胞相比,A549-BMP、GLC82-BMP和PC9-BMP细胞中lnc-BMP1-1分别上升714、2280和4743倍。2.过表达的lnc-BMP1-1抑制A549和GLC82细胞的增殖、转移或（和）迁移,对应抗凋亡蛋白Bcl-2下降;但PC9-BMP细胞的增殖与A549-BMP和GLC82-BMP细胞存在差异,且Bcl-2蛋白的轻微上升。（三）Cav-1是lnc-BMP1-1的靶基因结合文献查阅和生物信息学分析,在肺癌人群中检测lnc-BMP1-1潜在的靶基因NPR1和Cav-1。Cav-1的表达在两组间的分布具有显著差异（P=0.001）,在肺癌中也多见表达下降（肺癌标本中P25=0.001,P50=0.003,P75=0.040,癌旁标本中P25=0.004,P50=0.012,P75=0.321,P=0.001）。经相关分析,Cav-1与lnc-BMP1-1的表达正相关,Cav-1与lnc-BMP1-1表达量的关联系数为0.211(P=2.873×10^-14),Cav-1与患者的吸烟史和远端转移也有关联（P=0.025和P=0.002）。与NC细胞对比,Cav-1的mRNA在A549-BMP细胞中上升,但GLC82-BMP细胞中不变化;Cav-1蛋白在A549-BMP细胞中上升,而在GLC82-BMP中不表达。随后通过香烟烟雾溶解物处理细胞,验证了lnc-BMP1-1和Cav-1的共表达关系。在第5和第10代香烟烟雾溶解物处理的16HBE细胞中,lnc-BMP1-1和Cav-1的表达量逐渐下降。（四）裸鼠成瘤试验综合分析过表达lnc-BMP1-1对三种肺腺癌细胞功能表型的影响,仅选取A549-BMP和A549-NC细胞进行裸鼠成瘤试验,过表达的lnc-BMP1-1抑制了A549细胞的裸鼠皮下肿瘤的体积和重量。（五）Lnc-BMP1-1对肺腺癌A549细胞中Cav-1的调控机制1.TSA对A549细胞中lnc-BMP1-1、Cav-1的表达影响较5AZA更显著,提示组蛋白乙酰化调节途径占优;TSA影响了DNMT3a的mRNA表达水平。2.在A549细胞中lnc-BMP1-1和Cav-1的表达正相关,与人群实验结果一致,仅选取A549细胞进入机制试验。在A549细胞中,过表达的lnc-BMP1-1降低HDAC2的蛋白水平,促进Cav-1转录;DNMT3a蛋白下降,但尚未发现对Cav-1启动子区的甲基化水平有影响。（六）药敏实验相同的盐酸多柔比星处理条件下,过表达的lnc-BMP1-1使A549细胞的活力从47%降至34%,有统计学差异（P<0.05）;而过表达的lnc-BMP1-1对顺铂的处理无增敏作用（P>0.05）。结论1.Lnc-BMP1-1在肺癌组织中相对低表达,并与患者的吸烟史、临床进展及远端转移均有关。2.过表达的lnc-BMP1-1能够抑制肺癌A549细胞的增殖、迁移、转移及裸鼠成瘤的速度,且对抗癌药物盐酸多柔比星有增敏性。3.人群实验显示lnc-BMP1-1和Cav-1的表达正相关,香烟烟雾溶解物可以使16HBE细胞中lnc-BMP1-1和Cav-1的表达下降,验证了二者的共表达关系。4.在A549细胞中,过表达的lnc-BMP1-1降低HDAC2的蛋白水平从而正向调控Cav-1的转录。尚未发现lnc-BMP1-1影响Cav-1启动子区的甲基化修饰。本研究创新之处本研究结合人群临床特征和lnc-BMP1-1的表达量,首次揭示了该lncRNA在肺癌发生发展中的功能及其对A549细胞中Cav-1基因在转录水平的调控机制;利用香烟烟雾溶解物和16HBE细胞,模拟吸烟对正常肺支气管上皮细胞在RNA表达水平的影响。吸烟可能是lnc-BMP1-1低表达的原因之一,提示它是潜在的吸烟效应性生物标志物和肺癌发生发展的肿瘤分子标志物。本研究的不足之处Lnc-BMP1-1、Cav-1和吸烟的关联研究仍可以通过人群实验继续深入;lnc-BMP1-1通过HDAC2对的Cav-1调控机制研究可以继续深入。研究总结Lnc-BMP1-1在肺癌组织中相对低表达,且其在肺部表达丰度高、长度仅228nt,是理想的生物标志物;lnc-BMP1-1的低表达与吸烟有关,还关联了肺癌的临床进展和远端转移;香烟烟雾溶解物使16HBE细胞中lnc-BMP1-1和Cav-1的表达量减少。Lnc-BMP1-1能抑制A549细胞的增殖、迁移、转移及裸鼠皮下成瘤速度。但lnc-BMP1-1调控机制复杂,既可以通过降低HDAC2的蛋白水平从而促进Cav-1的转录,或还参与转录后调控来影响细胞功能。Lnc-BMP1-1对盐酸多柔比星有增敏作用。