研究目的1.采用脊神经结扎(Spinal Nerve Ligation,SNL)模型,模拟神经病理性疼痛(Neuropathic Pain,NP)的疾病状态,考察乌头汤缓解NP的镇痛作用特点,并分析其作用于NP的病理环节。2.通过网络药理学方法预测乌头汤缓解NP的分子调控机制,并结合化学特性评价、分子对接模拟、表面等离子共振结果筛选乌头汤缓解NP的关键药效物质。3.采用两种NP动物模型,借助激动剂和拮抗剂从正、反两个方向,验证乌头汤缓解NP关键药效物质的镇痛作用及其分子调控机制。研究方法1.乌头汤缓解NP的药效特点及其药理作用探索1.1动物及分组实验动物为雄性ICR小鼠(8周龄),无特定病原体(SPF)级。组别设置为:假手术组(Sham)、SNL组、SNL-乌头汤低剂量组(3.15g/kg,约为临床日剂量的0.5倍)、SNL-乌头汤中剂量组(6.30g/kg,约为临床日剂量的1倍)、SNL-乌头汤组(12.60g/kg,约为临床日剂量的2倍)。从手术后第一天开始灌胃给药,连续给药21天,Sham组及SNL组用等体积的蒸馏水代替。1.2镇痛药效学指标的检测1.2.1机械痛阈值在符合行为学检测的场所,使用不同力度的von Frey纤维丝在实验动物左后肢足底给予机械刺激,每次持续刺激3-4s,采用上-下法检测动物缩足或停止缩足的数值,间隔5分钟,共测3次,利用公式计算机械痛阈值。1.2.2热痛阈值将动物放入有机玻璃盒组成的隔间装置中,隔着玻璃在左后肢足底表面的中部使用红外辐射热源给予温度刺激,为防止动物组织损伤,将功率设置为40 W,切断时间为20 s,间隔5分钟,共测3次,分别记录每次实验动物对热辐射刺激的延迟时间。1.2.3炎症因子及趋化因子蛋白表达量的检测采用ELISA试剂盒,按照说明书操作,检测不同组别小鼠L5脊髓背角组织中炎症因子IL-1 β、TNF-α以及趋化因子CCL2、CXCL1的含量。1.3转录组表达谱检测检测组别为Sham组、SNL组和SNL-乌头汤(12.60 g/kg)组,提取并纯化上述组别小鼠脊髓背角组织中的总RNA,按照安捷伦表达谱芯片的说明操作,共检测41174个编码基因。1.4差异表达基因的筛选与分析不同组别差异表达基因的选择标准为①|log2-fold change(FC)|>0.5②P<0.05,将符合标准的差异表达基因使用R热图包进行分层聚类分析、基于欧氏距离的3.0聚类软件进行聚类分析。1.5“基因-基因”相互作用网络的构建与分析根据转录组表达谱检测得到的差异表达基因信息,分别构建“SNL所致NP失衡网络”、“乌头汤-SNL相互作用网络”,采用Navigator软件(Version 2.0.1)进行网络可视化。若基因-基因之间的相互作用值高于均数则用于下一步分析。网络中基因被定义为节点;节点之间的连线被定义为边,代表基因之间的相互作用关系;具有拓扑重要性的节点被称作hub节点,节点的拓扑特征值包括连接度、节点介度、节点紧密度和K-core值。1.6通路富集分析基于KEGG生物学通路数据库,采用DAVID在线分析工具,对乌头汤发挥镇痛作用的关键候选靶标进行通路富集分析,若信号通路P<0.05,则被视为具有富集显著性。2.乌头汤缓解NP的分子机制挖掘及关键药效物质筛选2.1乌头汤候选靶标谱的获取以及疾病相关基因的收集本课题组前期基于化合物-药物的结构相似性原理,预测了乌头汤所含化学成分的候选靶标谱;从OMIM和Drug bank数据库检索NP相关的基因,去除冗余得到NP疾病相关的基因集。2.2“NP相关基因-乌头汤候选靶标”相互作用网络的构建与分析采用STRING数据库获取NP相关基因与乌头汤候选靶标的相互作用关系,进而构建“NP相关基因-乌头汤候选靶标”相互作用网络,网络可视化后计算其中节点的拓扑特征值,所有拓扑特征值的中位数设置为卡值,若节点的所有网络拓扑特征值均大于中位数值,则认为该节点具有拓扑重要性,可视为乌头汤缓解NP的关键网络靶标。2.3通路富集分析见 P2,1.6。2.4分子对接通过ChemDraw软件准备化合物的结构信息,从RCSB蛋白数据库收集靶标的蛋白信息。采用pyMOL插件GetBox Plugin确定分子对接的活性口袋(适用于含有配体的蛋白分析,也适用于没有配体但有文献报道的蛋白),运用分子对接软件Ledock进一步模拟乌头汤镇痛候选活性成分与其靶标蛋白的结合情况。若分子对接数值的绝对值大于5,则认为化合物与相应靶标之间存在强结合。2.5表面等离子共振实验首先,活化靶标蛋白并通过共价反应将其固定在CM5芯片表面,封闭芯片,平衡体系,对于参考道,仅活化、封闭芯片表面,不固定靶标蛋白。其次,配置校正溶液,使不同浓度的化合物流经芯片表面,若化合物与靶标蛋白有相互作用,则会产生结合解离曲线。最后,通过Langmuir结合模型拟合响应曲线,即可得到化合物与靶标蛋白的结合速率常数ka、解离速率常数kd,以及解离平衡常数KD。2.6药物的药代动力学特征检测采用液-质联用的方法,检测健康雄性SD大鼠单次灌胃芍药苷-甘草苷组合或乌头汤后,芍药苷、甘草苷在血浆中的药代动力学特征。根据镇痛药效的预实验确定药物的剂量,其中,乌头汤选择镇痛最佳剂量即15g/kg(相当于4倍临床日用量);芍药苷-甘草苷组合为芍药苷37.3mg/kg+甘草苷15.1mg/kg(4倍临床日用量乌头汤中芍药苷、甘草苷的含量)。根据药代动力学预实验的结果,设置四个检测时间点于实验动物眼内眦取血,分别为给药后5min、30min、120min和360min。3.乌头汤缓解NP关键药效物质的镇痛作用及其分子调控机制验证3.1动物及分组健康雄性SD大鼠(180-220g),用于构建两种NP模型,分别是SNL模型、鞘内注射CCR5的天然配体巨噬细胞炎性蛋白(Macrophage Inf lammatory Protein,MIP)诱导的NP模型。为考察关键药效物质组合(Bioactive compounds,BAC)的镇痛作用和分子调控机制,共设置两个实验集。基于SNL模型的实验集共设置10个组别:Sham组、SNL组、SNL-乌头汤组、SNL-BAC(芍药苷+甘草苷)组、SNL-Maraviroc(CCR5 的拮抗剂 MVC)组、SNL-MVC+乌头汤组、SNL-MVC+BAC组、SNL-芍药苷(Paeoniflorin,PAE)组、SNL-甘草苷(Liquiritin,LIQ)组、SNL-普瑞巴林(Pregabalin,PGB)组;基于MIP诱导NP模型的实验集设置4个组别:Sham组、MIP组、MIP+乌头汤组、MIP+BAC组。3.2镇痛药效学指标的检测3.2.1机械痛阈值见 P11,2.1。3.2.2冷痛阈值在符合行为学检测的场所,将动物置于检测装置内,待其处于清醒、安静的状态后,使用20 μ L丙酮刺激左侧后肢的足跖部皮肤。记录30s内动物缩足或舔足的次数,间隔5分钟,共测3次。评分标准为:0分-动物无反应;1分-动物立即缩足但次数少于2次;2分-缩足3次以上;3分-持续性缩足并舔足。3.3乌头汤镇痛关键药效物质的分子机制验证3.3.1乌头汤及其镇痛药效物质对趋化因子信号通路的调控作用分别采用Western blot、RT-PCR、免疫组织化学染色方法,检测趋化因子信号通路成员分子在蛋白和基因水平的表达情况。3.3.2乌头汤及其镇痛药效物质对炎症因子的调控作用采用ELISA方法,按照TNF-α、IL-1 β和IL-6试剂盒的说明,分别检测不同组别大鼠血清中上述三种炎症因子的含量。研究结果1.乌头汤的镇痛作用特点1.1 SNL模型的评价与Sham组相比,SNL模型导致动物短期(1-2天)及持续性的(21天)的机械痛阈值降低、对热刺激的延迟时间缩短(均P<0.05);脊髓背角组织中炎性因子和趋化因子的蛋白表达量增加(均P<0.05)。1.2乌头汤可以有效缓解SNL小鼠的疼痛症状行为学结果表明,SNL小鼠在乌头汤给药后机械痛阈值和热痛阈值均显著升高(均P<0.05)。给药后持续至少2小时,其中给药1小时后效果最佳。连续每天给药的情况下,第7天给药后乌头汤镇痛时-效关系与第1天类似,表明动物未对乌头汤产生药物耐受问题。Sham组小鼠在乌头汤给药后,机械痛阈值和热痛阈值基线均未改变,提示乌头汤仅改变NP状态下动物的疼痛症状。ELISA结果表明,乌头汤在3.15～12.60 g/kg范围内可有效降低SNL小鼠L5脊髓背角中IL-1 β、TNF-α、CCL2、CXCL1的蛋白表达量。1.3 NP相关基因主要参与胶质细胞活化、神经-免疫反应和神经炎症转录组检测结果表明,SNL组与Sham组具有显著性差异,共有567个差异表达基因(上调基因331个、下调基因236个),包含18个已知NP相关基因(ADCY1、ADRA2A、B4GALT3、BRAF、BTG2、CHRNA4、DYNC1H1、EGFR、GL01、HTR1D、IL1R1、PDGFRA、PDPK1、PGR、PNPLA6、SCN1B、TEK 和 WARS)。“SNL所致NP失衡网络”包含765个节点和4774条边,其中248个hub节点为NP相关基因。通路富集分析结果表明,上述基因主要显著富集在胶质细胞活化、神经-免疫反应以及神经炎症相关的信号通路(P<0.05)。1.4乌头汤镇痛相关基因主要调控胶质细胞活化和神经炎症反应转录组检测结果显示,SNL-乌头汤组与SNL组,共有442个差异表达基因,其中171个为上调基因,271个为下调基因。此外,分层聚类分析结果表明,SNL-乌头汤组与SNL组具有显著性差异。根据上述差异表达基因构建的“乌头汤镇痛药效相关网络”,由375个节点和3077条边组成。其中,94个关键hub基因为乌头汤发挥镇痛效应的关键基因。通路富集分析显示,上述关键hub基因主要富集于胶质细胞活化和神经炎症相关的信号通路(P<0.05)。2.乌头汤镇痛关键药效物质及其网络调控机制的研究结果本课题组共鉴定出乌头汤及其所含五味中药水煎液中162种化学成分,用于药物的ADME特性评价。前期共得到乌头汤候选靶标1744个,其中107个是现存镇痛药物的作用靶标。通路富集分析显示,上述靶标主要参与神经炎症反应相关的信号通路,如趋化因子信号通路和TNF信号通路,等。基于“NP相关基因-乌头汤候选靶标”互作网络,筛选出453个hub节点,构建其直接相互作用网络,将其中具有网络拓扑重要性的130个关键hub节点,视为乌头汤的候选镇痛靶标。通路富集分析显示,上述靶标在趋化因子信号通路的富集显著性最高(P=6.30E-31),参与该通路的方药靶标有CCL5、CCR5、GNAI1、SRC、PIK3CA 和 AKT。将乌头汤中41种具有较好口服生物利用度和成药性的化学成分与其对应靶标进行分子对接,以分子对接的绝对值大于5.0作为卡值发现其中8种与其对应靶标具有请结合,其中芍药苷、甘草苷靶标中涉及多个趋化因子信号通路成员分子。进一步分别模拟芍药苷、甘草苷与趋化因子信号通路6个成员分子的结合情况,发现二者与上述6个靶标均呈现强结合。表面等离子共振实验检测结果表明,芍药苷、甘草苷与趋化因子信号通路最上游的CCL5蛋白之间的解离平衡常数(KD)分别为6.667μM、10.85μM,提示芍药苷、甘草苷均与CCL5蛋白具有微摩尔级别的强亲和力。血浆中药物的浓度可以在一定程度上反映药物在体内环境产生的药理效应,单次给药乌头汤(临床四倍等效量)或相当剂量的芍药苷-甘草苷组合后,发现与乌头汤相比,芍药苷-甘草苷组合给药后镇痛关键药效物质芍药苷、甘草苷的血药浓度峰值高、血药浓度达峰值时间短,提示组合药物在体内具有更大的暴露量。3.乌头汤镇痛关键药效物质组合的作用特点及其分子机制验证结果3.1乌头汤及芍药苷-甘草苷组合均可有效缓解SNL大鼠的症状采用SNL模型和MIP诱导NP模型的行为学检测结果表明,芍药苷-甘草苷组合可有效升高大鼠的机械痛阈值和冷痛阈值(均P<0.05),且药效与乌头汤全方相比,不存在显著性差异,但是优于单独给药芍药苷或甘草苷组(均P<0.05)。3.2乌头汤及其关键镇痛药效物质均可抑制趋化因子信号通路免疫组化结果显示,与Sham组相比,SNL大鼠脊髓背角组织中CCL5的表达明显增强;乌头汤及芍药苷-甘草苷组合均可显著降低SNL大鼠的CCL5的表达(均P<0.05);而单独给药芍药苷或甘草苷对CCL5的表达均无明显影响。此外,SNL大鼠L5左侧脊髓背角组织中CCL5、CCR5、GNAI1、SRC、PIK3CA和AKT的基因表达量均显著升高(均P<0.05),乌头汤及芍药苷-甘草苷组合均显著下调其基因表达量(均P<0.05),且芍药苷-甘草苷组合用药的效果优于单独使用芍药苷或甘草苷(均P<0.05)。蛋白水平的检测结果与基因水平的检测结果一致。ELSIA结果表明,乌头汤及芍药苷-甘草苷组合可以减少SNL大鼠血清中TNF-α、IL-1 β和IL-6的蛋白含量(均P<0.05)。上述研究结果表明,芍药苷-甘草苷组合可有效抑制趋化因子信号通路并减少炎症因子的表达量,表明芍药苷和甘草苷是乌头汤发挥镇痛效应的关键药效物质(均P<0.05)。研究结论本研究通过计算机预测与实验验证相结合的方法,预测乌头汤缓解NP的分子作用机制并筛选其关键镇痛药效物质,主要研究结论如下:1.采用SNL模型的药效学实验明确了乌头汤缓解NP的药效,具体表现在乌头汤可有效升高模型动物的机械痛阈值和热痛阈值,显著降低与胶质细胞活化相关的炎症因子和趋化因子的蛋白表达量;根据转录组表达谱的检测结果,分析NP的发病机制与乌头汤的镇痛机制,发现胶质细胞活化、神经-免疫反应和神经炎症是NP疾病进程中的三个关键病理环节,乌头汤的镇痛效应基因主要参与调控胶质细胞活化和神经炎症。2.预测乌头汤缓解NP的网络调控机制为抑制趋化因子信号通路(CCL5-CCR5-GNAI1-SRC-PIK3CA-AKT)介导的神经炎症,根据机制重要性,芍药苷和甘草苷被筛选为乌头汤缓解NP的关键镇痛药效物质。3.采用经典的SNL模型及鞘内注射MIP诱导的NP大鼠模型,验证了芍药苷-甘草苷组合缓解NP的药效(芍药苷、甘草苷的使用剂量为四倍临床等效剂量乌头汤中的含量),在该剂量条件下芍药苷-甘草苷组合的药效优于单独使用芍药苷或甘草苷。分子机制层面,芍药苷-甘草苷组合可以显著抑制趋化因子信号通路及炎症因子的表达。综上,本文综合利用转录组表达谱检测、药物靶标预测、网络构建与分析、分子对接、表面等离子共振检测、药代动力学特征分析、实验验证等方法,明确了经方乌头汤缓解NP的镇痛药效,揭示了乌头汤的镇痛关键药效物质芍药苷-甘草苷组合通过抑制趋化因子信号通路介导的神经炎症发挥缓解NP的分子机制。上述科学发现丰富了治痹经方乌头汤的镇痛科学内涵,同时,为研发药效成分清楚、作用机制明确、源于中药的镇痛组合药物提供实验依据。