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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS Virus,PRRSV)引起的病毒性传染病。PRRS给世界生猪养殖业带来了巨大的经济损失。PRRSV不断地突变和重组,致使多种变异毒株在各地流行传播。此外,PRRSV具有十分独特而复杂的免疫学特性,其致病机理也未完全揭示。因此对PRRS的控制并未取得实质性成效。本文将从PRRSV的流行变异情况和Nsp7β保守位点对病毒增殖的影响两部分进行探究,为PRRS的预防和治疗奠定基础。(1)PRRSV流行病学研究为了研究我国中部地区PRRSV的流行变异情况,我们扩增并分析了31份ORF5基因和18份Nsp2基因的高度变异区。基于全长ORF5核酸序列进行遗传系统进化分析,其中18株分离株属于NADC30-like毒株,11株分离株属于高致病性毒株(HP-PRRSVs)。同源性分析结果显示,NADC30-like PRRSVs分离株彼此间核酸序列同源性为91.71%-99.34%,HP-PRRSVs分离株彼此的同源性为98.84%-99.67%。氨基酸(aa)序列比对结果显示,HP-PRRSVs分离株几乎没有新氨基酸突变,但NADC30-like毒株则含有大量新氨基酸突变,尤其是在GP5蛋白的诱骗表位、糖基化位点等重要基序区域。值得注意的是,NADC30-like分离株HNhx含有S32H、N33D、D34N和S36G氨基酸变异,导致其丢失了在氨基酸30-35区段所有糖基化位点。为了进一步的了解当前流行的NADC30-like毒株的特性,我们分离了特殊变异株HNhx。全基因组测序与重组分析结果显示,HNhx毒株由NADC30毒株与高致病性毒株的疫苗毒株JXA1-P80重组而来,重组区域为Nsp4(nt 5,261)-Nsp9(nt 7,911)。以上结果表明,HP-PRRSVs依然在中部地区广泛传播,而NADC30-like毒株则逐渐开始流行;HP-PRRSV毒株相对趋于保守,NADC30-like毒株则经历了快速变异和演化过程。(2)Nsp7β保守位点的作用对46株Genotype II型PRRSV毒株全基因组氨基酸序列进行比对,我们发现虽然Nsp7β具有一定的变异性,但在所有PRRSV毒株中都存在一段21aa(aa 30-50)的保守序列。进一步与动脉炎病毒属中的其它成员比较发现,aa38位点在整个动脉炎病毒科中都相对保守。为了研究Nsp7β保守区域和位点对Nsp7β功能的影响,我们以HP-PRRSV毒株HN07-1为亲本毒株建立了PRRSV反向遗传操作平台。首先对HN07-1毒株进行了全基因组测序和分析,将全长基因组分4段构建到改造后的pCDNA3.1(+)载体中。同时也构建了在ORF1b和ORF2间插入EGFP的重组质粒。将构建完成的质粒转染PRRSV易感细胞Marc145,并进行盲传,盲传一代后,细胞出现了PRRSV感染典型的细胞病变效应,Western blot和IFA试验结果表明病毒拯救成功。将重组毒株分别命名为rHN07-1和rHN07-1-EGFP,生长动力曲线绘制结果显示,rHN07-1与亲本毒株HN07-1具有相似的生长动力特性,表明rHN07-1可以用于反向遗传操作。利用构建好的cDNA克隆为骨架,对Nsp7β保守区段和位点进行缺失或突变,构建重组质粒进行转染和拯救,结果显示保守区缺失以及aa37/38突变均不能拯救出病毒,因此推测aa37/38位点是Nsp7β发挥功能的关键位点。