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乳腺癌已成为女性癌症患者的第二大死因。通常,原发乳腺癌并不致命,但乳腺癌细胞侵袭其他器官甚至全身转移则常常是乳腺癌患者因癌致死的主要原因。乳腺癌的肿瘤信号转导蛋白磷酸化异常是导致乳腺癌侵袭性增强和发生转移的主要机制之一。p21激活激酶4(p21-activated kinases4,PAK4)是蛋白激酶PAKs家族中与人类肿瘤的发生和发展关系最密切的蛋白,它能通过促进某些肿瘤信号转导蛋白磷酸化,促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。本课题组的前期研究发现,PAK4在乳腺癌细胞系中与某些促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的蛋白的磷酸化过程有关,PAK4蛋白过表达与乳腺癌病人的预后不良相关。磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)信号转导通路已被众多研究者证明与多种人类肿瘤(包括乳腺癌)的发生和发展密切相关。人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN),具有脂质磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性,是PI3K的竞争性抑制分子。蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/AKT),是一种丝氨酸/苏氨酸(Serine/Threonine,Ser/Thr)蛋白激酶,是PI3K下游主要的效应物,在乳腺癌等多种恶性肿瘤细胞可检测到AKT的异常激活。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种非典型Ser/Thr蛋白激酶,是AKT的下游效应蛋白,能调控转录及蛋白质合成,对肿瘤细胞的生长和增殖有重要的影响。但是,在乳腺癌细胞中PAK4是否能够调控PI3K-AKT-mTOR信号转导通路,国内外文献也未见报道。因此,本研究从多个角度全面分析乳腺癌细胞中PAK4是否通过发挥其激酶活性作用,调控PI3K的表达以及其下游信号转导通路蛋白的磷酸化,从而促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭;旨在探索乳腺癌细胞中PAK4调控PI3K-AKT-mTOR信号转导通路的机制,为阐明乳腺癌的转移机制和进一步开发利用蛋白激酶抑制剂向乳腺癌的治疗提供新的理论依据。 首先,我们分别采用RNA干扰和质粒转染,在迁移和侵袭能力均较强的MDA-MB-231细胞系中敲减PAK4和PTEN表达以及使PAK4和PTEN过表达。实验结果发现: (1)敲减PAK4表达后,PI3K、p-AKT和p-mTOR的蛋白表达下调,而PTEN、总AKT和总mTOR蛋白表达无明显变化; (2)过表达PAK4后,PI3K、p-AKT和p-mTOR的蛋白表达上调,而PTEN、总AKT和总mTOR蛋白表达无明显变化; (3)敲减PTEN表达后,PI3K和p-AKT的蛋白表达上调,而总AKT和PAK4蛋白表达无明显变化; (4)过表达PTEN后,PI3K和p-AKT的蛋白表达下调,而总AKT和PAK4蛋白表达无明显变化。 为了从另一个角度印证PAK4是上游基因,它能调控下游PI3K-AKT-mTOR信号通路,我们分别使用PAK4小分子抑制剂PF-3758309和PI3K抑制剂LY294002作用于稳定过表达PAK4的MDA-MB-231细胞系和对照细胞系。实验结果发现: (1)随着PF-3758309工作浓度的梯度上升,实验组和对照组中PAK4和PI3K的蛋白表达出现梯度下调,p-AKT和p-mTOR的蛋白表达也出现与PAK4变化一致的下调,而总AKT和总mTOR的蛋白表达则无明显变化; (2)过表达PAK4造成的PI3K、p-AKT和p-mTOR的蛋白表达上调可被PAK4抑制剂PF-3758309逆转; (3)当LY294002作用时间到5h时,实验组和对照组中PI3K、p-AKT和p-mTOR的蛋白表达均出现轻微下调;当LY294002作用时间延长到15h时,两组中PI3K、p-AKT和p-mTOR的蛋白表达均明显下调,而AKT和mTOR的蛋白表达未出现明显变化; (4)过表达PAK4造成的AKT和mTOR的蛋白磷酸化可以被PI3K抑制剂LY294002部分逆转。 我们用分别稳定转染了shNC、shPAK4、Vector和PAK4质粒的四个 MDA-MB-231细胞系做系列功能实验,包括CCK-8细胞增殖实验、克隆形成实验、划痕实验、迁移和侵袭实验。实验结果显示:敲减PAK4后细胞增殖、迁移及侵袭能力明显下降,而过表达PAK4可以促进乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭。 为了进一步验证PAK4可发挥蛋白激酶的作用调控PI3K-AKT-mTOR信号转导通路,我们使用了不同激酶活性的PAK4质粒(分别是对照质粒Vector,激酶持续活化质粒PAK4Ser,野生型质粒PAK4,和激酶灭活质粒PAK4KD)去稳定转染 MDA-MB-231细胞系并观察PI3K-AKT-mTOR信号转导通路中相关蛋白的表达变化。实验结果发现: (1)与Vector组比较,PAK4Ser组、PAK4组和PAK4KD组中PAK4、PI3K、p-AKT和p-mTOR的蛋白表达有不同程度的上调,其中,PAK4的蛋白表达的上调程度在PAK4Ser组、PAK4组和PAK4KD组中基本一致; (2)PI3K、p-AKT和p-mTOR的蛋白表达的上调程度在PAK4Ser组、PAK4组和PAK4KD组中依次逐渐降低,但均高于Vector组; (3)AKT和mTOR的蛋白表达则无明显变化。 我们使用上述四个细胞系进行CCK-8细胞增殖实验和克隆形成实验,观察不同激酶活性的PAK4质粒对MDA-MB-231细胞的增殖能力的影响。CCK-8细胞增殖实验结果提示:另外三组细胞随着时间延长细胞增殖能力均较Vector组强,它们的细胞增殖能力由强到弱依次为PAK4Ser组、PAK4组和PAK4KD组。克隆形成实验结果提示:四组细胞的克隆形成率不同,由高到低依次为PAK4Ser组(84.0±3.18)%、PAK4组(77.3±4.21)%、PAK4KD组(68.1±2.83)%,Vector组(57.6±2.89)%。我们又使用上述四组细胞进行进行划痕实验、迁移和侵袭实验。划痕实验结果提示: (1)与Vector组相比,PAK4Ser组、PAK4组和PAK4KD组的迁移潜能及愈合能力均有不同程度增强; (2)24小时时,PAK4Ser组的划痕完全愈合,PAK4组的划痕接近愈合,PAK4KD组的划痕大部分愈合。迁移实验结果提示:四组细胞的迁移能力不同,由强到弱依次为PAK4Ser组(82.7±8.62)%,PAK4组(74.0±6.0)%,PAK4KD组(46.3±6.11)%,Vector组(32.3±4.93)%。侵袭实验结果提示:四组细胞的侵袭能力不同,由强到弱依次为PAK4Ser组(58.3±2.52)%,PAK4组(37.0±4.58)%,PAK4KD组(31.7±3.51)%,Vector组(20.7±3.79)%。上述实验说明:不同激酶活性的PAK4质粒对MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响不同;激酶活性越高,对MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭能力的影响越明显。 综上所述,本研究的主要结论有: 1.PAK4能发挥其蛋白激酶活性促进PI3K的蛋白表达; 2.PAK4能促进AKT和mTOR的蛋白磷酸化; 3.PAK4不能调控PTEN的蛋白表达,PTEN也不能调控PAK4的蛋白表达; 4.PAK4能通过调控PI3K实现对AKT、mTOR的蛋白磷酸化的促进作用; 5.PAK4通过发挥其蛋白激酶活性促进促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。