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研究背景及意义腰痛是造成社会劳动力丧失的首要原因,由于这种疾病造成的残疾则导致更大的社会经济损失,给家庭和社会带来沉重的负担。虽然腰痛的发病机制还不完全清楚,但大量证据表明,椎间盘退行性疾病为最常见的原因,退变本质特征是椎间盘内有核细胞数量减少和功能降低。为了恢复椎间盘原有的解剖及生理功能,很多研究者转向生物治疗方向寻找可行性方案,其最可行的方法就是椎间盘的组织工程治疗,其中干细胞治疗被认为是最有前景的治疗方法。很多研究已经表明,干细胞与髓核细胞共培养后可向髓核细胞方向分化,但其中的具体机制仍不清楚。近年来,关于外泌体的研究逐渐成为热点,外泌体是由细胞内多囊泡体形成并分泌到细胞基质中的一类囊泡,通过自分泌、旁分泌或远距分泌方式与其他细胞进行相互作用。其功能与细胞来源密切相关。在本研究中我们提出假设,髓核细胞来源的外泌体具有某些髓核细胞的功能,参与了髓核细胞与干细胞共培养中的信息传递,是髓核细胞诱导干细胞分化的潜在机制。研究方法:1.髓核细胞外泌体提纯方法:1)髓核细胞取自椎间盘手术病人术后椎间盘组织,进行体外培养扩增;2)制备去血清外泌体的完全培养基,对髓核细胞培养48小时后收集细胞培养液;3)采用差异超速离心法对髓核细胞外泌体进行分离提纯。2.髓核细胞外泌体的鉴定:1)用透射电子显微镜对提取的髓核细胞外泌体进行大小及形态的观察;2)通过western-blot检测其表达外泌体标志蛋白的情况,并对其所含细胞碎片及细胞器等杂质蛋白进行鉴定。3.髓核细胞外泌体被骨髓间充质干细胞摄取的观察:利用亲脂性荧光染料PKH67对外泌体脂质膜进行标记,然后与骨髓间充质干细胞共孵育后,通过激光共聚焦显微镜观察骨髓间充质干细胞对髓核细胞外泌体的摄取情况。4.髓核细胞外泌体诱导骨髓间充质干细胞向髓核细胞分化:1)用髓核细胞外泌体对骨髓间充质干细胞进行诱导3,7,10,14天后,观察BMSCs的形态变化及阿尔新蓝染色观察其表达糖胺聚糖的变化,另外利用qRT-PCR及WB方法对髓核特异性表达基因Aggrecan、SOX-9、Collagen II、HIF-1α、CA12及KRT19进行检测,观察其向髓核细胞分化的情况。2)对比髓核细胞外泌体对骨髓间充质干细胞的诱导分化与间接共培养系统的差异,实验组为髓核细胞外泌体诱导骨髓间充质干细胞分化的外泌体组,利用transwell嵌套系统进行髓核细胞与骨髓间充质干细胞的共培养组和空白骨髓间充质干细胞作为对照组,对上述基因进行检测,比较这两种不同方式在诱导骨髓间充质干细胞分化中的差异。结果:1.人髓核细胞可以分泌胞外囊泡,且这些囊泡具有经典外泌体的大小形态及标志蛋白。这些囊泡大致分布在30-100nm之间,且高表达外泌体标志蛋白CD63及Tsg101,证明其起源于细胞内多囊泡体,属于外泌体。同时所提取的囊泡不表达Calnexin,排除其为细胞碎裂后释放的内质网成分,说明经差异超速离心法获得的髓核细胞外泌体纯度较高,无细胞器杂质污染。2.髓核细胞外泌体在体外可以被骨髓间充质干细胞所摄取,且其摄取方式为胞吞作用。3.骨髓间充质干细胞经过髓核细胞外泌体诱导3、7、10、14天后,观察骨髓间充质干细胞形态学变化,阿利新蓝染色观察其蛋白聚糖的分泌情况,q RT-PCR检测分化后的骨髓间充质干细胞表达髓核细胞特异标志物ACAN、SOX-9、Col2a1、CA12、HIF-1α和KRT19均呈明显上升趋势,7天以后与空白对照组比较差异显著(P<0.05)。Wsetern-blot检测Aggrecan、Sox-9、collagen II、CA12和KRT19表达变化与基因水平基本一致。4.髓核细胞外泌体对骨髓间充质干细胞分化诱导能力明显强于transwell共培养系统。两组实验组与空白对照组比较ACAN、SOX-9、Col2a1、CA12、HIF-1α和KRT19基因表达均升高,两组实验组比较除KRT19表达无统计学差异外,外泌体组骨髓间充质干细胞表达其他髓核细胞标志物的水平显著高于共培养组及空白对照组(P<0.05)。结论:本实验通过对人髓核细胞的体外扩增培养,利用差异超速离心法首次分离提纯了髓核细胞外泌体,这些外泌体具有经典外泌体的大小形态同时表达外泌体特有标志蛋白。髓核细胞外泌体可以被骨髓间充质干细胞所摄取,经基因及蛋白水平检测发现其产生的效应为促使骨髓间充质干细胞向髓核细胞方向分化,通过与间接共培养方式比较发现,经髓核细胞外泌体诱导分化的骨髓间充质干细胞表达髓核细胞标志物水平高于间接共培养系统。由此推断,髓核细胞可以分泌外泌体,其携带髓核细胞的特定信息通过远距运输或旁分泌的形式到达受体细胞并被摄取,从而调节靶细胞的生物学功能。在既往椎间盘退变的干细胞治疗中,通过人工诱导的方式获取类髓核细胞来源少效率低,髓核细胞外泌体在诱导骨髓间充质干细胞分化的作用中比共培养系统更有优势,通过髓核细胞外泌体诱导骨髓间充质干细胞,可以为椎间盘退变的组织工程修复提供更为简单有效的髓核细胞来源。