论文部分内容阅读
实验背景：尽管人们对降脂降压治疗及生活方式的改变越来越重视,冠心病仍然是导致发达国家死亡的首要原因,其发病率不断上升,如今发病年龄更有年轻化的趋势。心肌梗塞是指冠状动脉的某一分枝闭塞、血流中断造成该分枝所营养的心肌持久性缺血坏死。如果病变范围过大或抢救措施不力,会导致心脏破裂、心源性休克、猝死等严重后果。如果抢救及时,坏死心肌可以通过斑痕修补,但大多会造成心律不齐、心功能不全等病症。外周动脉病主要是指由动脉粥样硬化导致的机体除冠状动脉和颅内动脉外的动脉闭塞症,主要累及下肢动脉。它是一种进展性疾病,发病率随年龄增长而升高。约25%的患者最终需要血运重建治疗,5%的患者发展为重度下肢缺血。而这些重度下肢缺血患者目前治疗手段有限,部分患者最终因为严重缺血导致截肢,而截肢后的预后并不佳。上述两种疾病的一个共同点是都可引起动脉急性闭塞导致肢体缺血(各种原因导致的肢体血供突然减少或中断,引起组织缺血缺氧),常发生于动脉粥样硬化基础之上。栓塞和血栓形成是动脉急性闭塞的两个主要原因,发病突然,症状明显,进展迅速,如不及时处理,常很快导致组织器官缺血坏死甚至危及生命。目前主要的治疗方法是血运重建术和溶栓治疗。两种治疗方法均有不容忽视的并发症及禁忌症,因此有必要探索新的治疗方法。有文献报道当发生血管狭窄或急性闭塞时,其中一个预测预后恢复程度的重要因素是机体能否建立良好的侧枝循环。侧枝循环的建立在发病过程中起到重要作用,他们可以减少梗死面积,减少心力衰竭及相关并发症的发生,改善心脏或肢体功能,改善预后,提高闭塞病人的存活率。但影响血管新生的因素目前还有待进一步研究。位于胞膜上的原癌基因c-kit编码一种跨膜蛋白——肥大细胞生长因子受体,这种受体在特定的细胞(肥大细胞和黑色素细胞)中表达。干细胞因子(SCF)是c-kit的天然配体,常常作为肥大细胞,嗜酸性粒细胞,造血祖细胞,淋巴细胞等的重要调控靶点。c-kit与干细胞因子(SCF)结合后,导致包括磷脂酰肌醇-3-激酶、磷脂酶C-γ、致敏反应细胞激酶蛋白酪氨酸激酶／信号传导及转录活化因子和有丝分裂原激活蛋白等多种路径的激活,从而调节细胞的存活、活化及多种生物活性物质的表达,参与炎症、免疫、肿瘤的发生和发展等多种生理及病理过程。尤其对肥大细胞和黑色素细胞的形成、成熟及增殖迁移有重要作用。目前,kit基因敲除的小鼠常常作为用来研究肥大细胞缺失的模型。已有研究表明,SCF/c-kit受体上调肿瘤浸润、转移及生长有关的多种细胞因子的表达,如IL-6,IL-8,肿瘤坏死因子(TNF-α),黏附分子(VCAM-1, ICAM-1)及血管内皮生长因子等。但是kit基因和组织缺血坏死和血管新生间有没有直接的因果关系还不明确,目前未见相关报道。此外,CD4细胞是人体免疫系统中的一种重要免疫细胞,主要表达于辅助T(Th)细胞,是Th细胞TCR识别抗原的供受体。T细胞是体内免疫系统和炎症系统的组成部分,包括CD4和CD8两个亚群,参与创伤愈合,宿主防御感染反应等生理过程及肿瘤生长,粥样硬化斑块形成等病理过程。这些过程的一个共同机制是血管发生。肥大细胞衍生因子,包括TNF-α显示肥大细胞通过细胞因子直接影响T细胞的反应。相反,肥大细胞-T细胞相互作用的机制尚未完全阐明。肥大细胞在炎症环境下移行到脾脏和淋巴结,在细胞表面表达促生成或抑制因子,这个结果提示肥大细胞刺激T细胞的作用是直接的。有实验显示裸鼠(即缺乏所有T细胞组分的小鼠)在侧支形成过程中显著受损,提示CD4+和CD8+T细胞在侧支血管形成中起作用。实验目的：本研究以kit基因敲除小鼠(kit-／-)(C57BL／6种系)和野生型C57BL／6小鼠(WT)为实验对象,观察kit基因在小鼠急性下肢缺血中对组织坏死的作用,以及在随后恢复期中对血管新生的效应。同时观察两组实验小鼠T细胞各亚群表达的差异以及CD4+T细胞回输后对急性下肢缺血恢复期所起的作用。实验方法：WT和kit-／-小鼠(18-25g)经4%水合氯醛腹腔注射麻醉,结扎左侧股动脉近段、远端及其主要分支,右侧股动脉作假手术处理,仅分离股动静脉而不结扎。术后1,3,7,14天对下肢缺血损伤进行半定量评估(0分：没有改变；1分：轻度肤色改变；2分：中到重度肤色改变；3分：坏死；4分：自发截肢。每组8只)。术前及术后1,3,7和14天动物用4%水合氯醛麻醉后用激光多普勒灌注成像系统测量双测下肢血流灌注值。为探讨kit基因敲除对缺血后血管新生的影响机制,术前及术后1,3,7和14天两组各处死8只小鼠,取等量内收肌提取蛋白标本行westernblot测定血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的表达,取腓肠肌标本免疫组化染色CD31和CD4,CD31标记小血管数。各小鼠处死前眼眶取血,置于抗凝管中,一半标本高速离心后取血清,ELISA测定IL-6,TNF-α表达。另外一半标本行流式细胞术观察两组T细胞亚群CD4, CD8表达差异。流式结果发现kit-／-组比WT组外周血CD4表达明显下降,CD8表达差异不明显。在此基础上,再取WT未手术小鼠外周血,分离淋巴细胞,流式细胞无菌分选CD4+T细胞,经尾静脉回输入kit-／-手术当天小鼠,观察其对急性缺血下肢血流恢复的影响。另外,kit-／-小鼠和WT小鼠6只,分别心脏取血,分离淋巴细胞,行transwell观察两组小鼠来源淋巴细胞跨人脐静脉内皮细胞迁徙率的差异。实验结果：术后3,7,14天kit-／-组缺血下肢血流灌注值显著低于WT组(分别为13.85±1.23和25.40±0.89,P=0.002；29.05±1.17和43.30±1.03,P<0.001；36.07±1.15和52.92±2.70,P=0.029),然而术后1天,两组间的缺血下肢血流灌注值差别无统计学意义(8.67±0.55和12.72±0.72,P>0.05)。术后7,14天CD31免疫组化提示两组间新生小血管数kit-／-组显著低于WT组(分别为10.23±3.72／高倍视野和14.67±3.31／高倍视野,P=0.001；12.77±2.83／高倍视野和16.42±3.65／高倍视野,P=0.006),提示kit-／-小鼠缺血后小血管新生受损。术后3天CD4免疫组化结果显示kit-／-组表达显著低于WT组(22.45±7.23／高倍视野和37.36±8.54／高倍视野,P<0.001)。Western blot提示不同时期kit-／-小鼠VEGF表达较WT小鼠下调。另外,与WT小鼠相比,术后14天流式细胞术结果提示kit-／-小鼠CD4表达百分比相对WT小鼠显著下降(分别为10.67±6.10%和19.76±6.64%,P=0.001),对kit-／-结扎小鼠行WT小鼠外周血来源CD4+T细胞回输后,术后7,14天时CD31表达水平较未回输组有所上调(13.17±2.17／高倍视野和10.23±3.72／高倍视野,P=0.008；15.67±2.90／高倍视野和12.77±2.83／高倍视野,P=0.019),提示回输后小血管新生数目增加,术后7,14天下肢血流恢复较未回输CD4+T细胞kit-／-小鼠术后同时期相比,有明显改善(37.48±1.19和29.05±1.17,P=0.026；44.12±1.22和36.07±1.15,P=0.035)。Western blot提示VEGF表达较回输前上调。kit-／-小鼠和WT小鼠外周血分别提取淋巴细胞行transwell跨人脐静脉内皮细胞迁徙实验,发现kit-／-小鼠淋巴细胞跨内皮细胞迁移能力较正常WT小鼠下降(50.00±8.97／高倍视野和95.67±9.32／高倍视野,P=0.007)。实验结论：1、kit基因敲除显著降低缺血后新生血管的形成,使急性下肢缺血后侧枝血管形成过程受损。2、kit基因敲除小鼠体内CD4细胞的合成减少,缺血组织局部CD4细胞募集减少,免疫反应性下降,kit-／-小鼠来源淋巴细胞跨内皮细胞迁徙能力减弱。3、CD4+T细胞的回输可以改善下肢血流的恢复和新生血管的形成,进一步证实CD4减少是kit-／-小鼠血管生成减少的重要原因之一。4、kit基因是下肢缺血后血管新生活动的重要参与者,缺乏kit基因抑制了缺血后血管新生活动其下游介导机制可能与VEGF有关。