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目的：构建兔血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)真核表达质粒pcDNA3.1-VEGF165，并检测其序列及片段大小，为其在治疗骨缺损及软组织损伤的应用奠定基础。 方法：应用Trizol总RNA提取试剂盒，按照其要求步骤，从兔骨组织中提取总RNA，根据GENEBANK设计兔基因片段VEGF165引物，上游引物为：5’GTG GAC ATC TTCCAG GAG TA 3’，下游引物为：5’CTT TGG TCT GCA TTC ACA 3’，片段长度为187bp，逆转录制备cDNA，聚合酶链反应扩增产物，将此目的基因片断与pMD18-T载体在连接液混合连接，制备VEGF165真核表达载体；取连接产物加入感受态细胞溶液中进行转化，并将细胞涂布在含氨苄青霉素的平板上，37℃过夜，从平板上挑选单克隆鉴定，将阳性克隆接入LB培养基培养，用质粒DNA小量快速试剂盒抽提质粒，将产物行2％琼脂糖凝胶电泳及质粒测序；分别将质粒和pcDNA3.1。载体以EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切，反应体系体积20μ 1，37℃2h，以凝胶分别回收目的基因片断，取二者的回收产物与2u T4-DNA连接酶和buffer液混合连接，反应体系总体积10μ 1，37℃过夜，所得产物以2％琼脂糖凝胶电泳分析，并行质粒DNA直接测序。 结果：所得产物经2％琼脂糖凝胶电泳分析于5.4kb处出现特异性条带；双酶切产物行2％琼脂糖凝胶电泳分析发现分别于约5.4kb、187bp处出现特异性条带，测序表明pcDNA3.1-VEGFl65质粒的基因序列及方向正确。 结论：重组质粒pcDNA3.1-VEGF165构建成功。