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目的: B细胞淋巴瘤与抗凋亡基因Bcl-2的过表达密切相关,调低该基因的表达将有助恢复细胞凋亡功能,逆转肿瘤形成。RNA干扰(RNAi)能高效特异地调低基因表达,已广泛应用于肿瘤治疗的研究。本课题通过构建Bcl-2 shRNA重组质粒转染B细胞淋巴瘤Raji细胞,体内、外观察shRNA表达载体对Raji细胞Bcl-2基因表达的影响,以及对Raji细胞生长的抑制作用,为进一步研究B细胞淋巴瘤的基因治疗奠定实验基础。方法:○1软件分析Bcl-2 mRNA结构以筛选出拟干扰靶位点,构建Bcl-2 shRNA重组质粒pGenesil-1-Bcl-2-544和pGenesil-1-Bcl-2-1009,同时构建阴性对照重组质粒pGenesil-1-NC,经测序和酶切鉴定后,提取各重组质粒转染Raji细胞;○2实验分为空白对照组、pGenesil-1-Bcl-2-544组、pGenesil-1-Bcl-2-1009组和pGenesil-1-NC组进行体内、外实验。○3在48h时测定细胞凋亡和Bcl-2 mRNA相对含量,以观察各干扰重组质粒瞬时转染Raji细胞后对Bcl-2基因表达的抑制作用;○4 G418筛选获得各重组质粒的稳定转染Raji细胞,RT-PCR、FCM、Western-blotting测定Bcl-2 mRNA和蛋白的表达,细胞计数测定细胞增殖能力;○5各组稳定转染Raji细胞接种BALB/c裸鼠,建立B细胞淋巴瘤荷瘤裸鼠模型;通过观测成瘤时间、瘤体积和瘤重量,免疫组化测定Bcl-2蛋白表达,透射电镜观察瘤细胞超微结构,研究Bcl-2 shRNA对B细胞淋巴瘤移植瘤生长的抑制作用。结果:○1测序和酶切鉴定证实重组质粒pGenesil-1-Bcl-2-544、pGenesil-1-Bcl-2-1009和pGenesil-1-NC均成功构建;○2瞬时转染48h时,pGenesil-1-Bcl-2-544组和pGenesil-1-Bcl-2-1009组的凋亡指数分别是空白对照组的4.70和3.78倍(p<0.05),对Raji细胞Bcl-2基因表达的抑制率分别为31.91%和47.61%(与对照组相比,p<0.05);○3 G418成功筛选出各重组质粒稳定转染的Raji细胞,FCM测得各组稳定转染细胞百分率均达97%以上;pGenesil-1-Bcl-2-544和pGenesil-1-Bcl-2-1009对Raji细胞Bcl-2mRNA的抑制率分别为72.71%和45.50%,与对照组相比差异具有显著性意义(p<0.05);FCM测得Bcl-2蛋白抑制率分别为73.37%和59.67%(与对照组相比,p<0.05),Western-blotting结果与FCM结果基本相符;对各组细胞增殖速度的比较表明,两干扰组稳定转染细胞的增殖能力明显下降;○4 pGenesil-1-Bcl-2-544组和pGenesil-1-Bcl-2-1009组移植瘤的平均成瘤时间明显延迟,平均瘤体积、重量明显下降,切片的免疫组化结果进一步证实两干扰组Bcl-2蛋白表达明显下调,透射电镜显示两干扰组瘤细胞有一定比例的凋亡;○5稳定转染实验结果表明:pGenesil-1-Bcl-2-544组对Bcl-2基因的干扰作用较pGenesil-1-Bcl-2-1009组明显,抑制瘤细胞的增殖也更明显;而pGenesil-1-NC对Raji细胞Bcl-2基因无明显干扰作用,对瘤细胞的增殖无明显影响。结论:成功构建Bcl-2 shRNA重组质粒pGenesil-1-Bcl-2-544和pGenesil-1-Bcl-2-1009;两干扰重组质粒能在体内、外干扰Raji细胞Bcl-2基因表达,抑制B细胞淋巴瘤Raji细胞增殖;5’-GTACATCCATTATAAGCTG-3’和5’-CATCGCCCTGTGGATGACT-3’可作为B细胞淋巴瘤Raji细胞Bcl-2基因的RNAi靶点。