天然免疫是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道防线,天然免疫应答的活化,主要是通过模式识别受体(pattern-recognition receptors, PRRs)识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),从而激活一系列相关的信号转导通路,发挥免疫应答作用。PRRs主要包括Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs),维甲酸诱导的基因I样受体(RIG-I-like receptors, RLRs), NOD样受体(NOD-like receptors, NLRs)以及DNA受体。在天然抗病毒免疫中,I型干扰素的产生对于机体的抗病毒作用是非常重要的,机体受到病毒感染后,会引起转录因子IRF3的活化,从而引起下游的Ⅰ型干扰素的产生。Ⅰ型干扰素产生之后与相应受体结合,引起干扰素诱导基因产物(ISG)的表达,产生的众多干扰素相关蛋白分子主要起到抵抗病毒感染的作用,通过抑制病毒的复制或是通过凋亡途径引起被感染细胞的凋亡,协同发挥着抗病毒作用。因此,Ⅰ型干扰素对于机体的抗病毒作用是至关重要的。Ⅰ型干扰素的产生主要依赖于转录因子IRF3的活化,IRF3作为机体重要的转录因子,在Ⅰ型干扰素产生以及机体各信号通路发挥抗病毒作用中都是至关重要的。与此同时,IRF3作为机体抗病毒作用中非常重要的转录因子,IRF3的活化需要磷酸化,二聚化以及核转位共同的参与,然而对于核内活化形式IRF3的调节作用的研究目前来说还是不明确的。目前已有文章报道显示去磷酸化以及泛素化可以抑制转录因子IRF3的活性,接头分子RACK1可以募集磷酸酶PP2A对磷酸化的IRF3进行去磷酸化作用。也有文章报道,在SeV感染情况下,IRF3C末端的磷酸化可以促进IRF3的蛋白酶体降解作用。但是,目前来说尚未明确能够泛素化和降解核内IRF3的E3连接酶。TRIM26分子属于tripartite motif (TRIM) E3连接酶家族中的一员,在人类中,TRIM家族大约有超过70个成员。TRIM家族成员拥有相似的结构特点,主要包括N末端的一个RING结构域,一个或是两个B-boxes结构域,以及一个coiled coil结构域,C末端是一个可变结构域。目前已有很多报道发现E3连接酶在TLR,RLR,NLR以及DNA信号通路中发挥着重要作用,E3连接酶主要通过不同的蛋白质修饰调节众多信号通路中的接头分子的蛋白质表达水平或是蛋白活性的变化,从而起到影响相应信号通路活性的作用。E3连接酶通常以K48偶联的泛素化形式通过蛋白酶体途径降解相应的接头分子,也可以通过K63偶联的方式影响相应的蛋白质分子的活性,同时E3连接酶也可以通过其他的泛素化形式如K11,K27等方式影响信号通路的活化。虽然目前已有很多关于E3连接酶在信号通路中的调节机制被发现,但是关于E3连接酶如何参与到核内IRF3的活性调节还没有明确的报道。一.研究目的：TRIM26作为TRIM家族中重要的一员,之前在天然免疫中的研究是非常少的,鉴于TRIM家族的相似结构特点,考虑TRIM26作为一种E3连接酶是否会在天然免疫应答中起到泛素化修饰的作用,是否参与到TLR,RLR,NLR以及DNA信号通路介导的Ⅰ型干扰素的产生之中,并对机体的抗病毒免疫起到调控作用,同时验证TRIM26作用的靶分子以及是通过何种形式的泛素化形式起到相应的作用。二.研究方法：1.病毒感染对TRIM26的调控1.1病毒感染对TRIM26表达的影响取小鼠的各种组织,利用Western Blotting方法,检测小鼠各组织中的TRIM26蛋白的表达。用LPS和poly(I:C)刺激,以及SeV感染小鼠腹腔原代巨噬细胞,利用Western Blotting方法检测TRIM26在各种刺激以及感染情况下的表达变化。1.2 TRIM26在细胞内的定位构建带GFP荧光标签的TRIM26过表达载体,转染到HEK293细胞,利用免疫荧光技术观察TRIM26在细胞内的定位,同时,用LPS刺激或是SeV感染之后,免疫荧光检测一下TRIM26定位的变化。2.TRIM26负向调控IFN-β的产生和抗病毒免疫2.1 TRIM26过表达对IFN-β产生的影响在RAW264.7细胞系中,转染TRIM26过表达载体以及IFN-β报告基因载体,培养过夜,之后用LPS和poly(I:C)刺激转染过的RAW264.7细胞系,报告基因检测IFN-β活性水平。同样方法,利用报告基因方法在稳定表达TLR3,TLR4受体的HEK293细胞中检测TRIM26对IFN-β报告基因的活性水平。2.2 TRIM26干扰之后对IFN-p产生的影响取小鼠的腹腔原代巨噬细胞,利用转染小干扰RNA的方法,将TRIM26相应的干扰RNA转染进巨噬细胞,用LPS和poly(I:C)刺激,以及SeV感染,ISD转染相应的时间,ELISA方法检测IFN-p的产生变化。2.3 TRIM26的抗病毒影响将TRIM26过表达载体转染Hela细胞,然后用VSV进行感染,RT-PCR检测IFN-p的产生变化以及VSV的mRNA水平的变化。将TRIM26过表达载体或是相应的小干扰RNA转染Hela细胞系,24小时后用VSV感染Hela细胞8小时,收集细胞上清,利用病毒空斑试验检测病毒的数量。3.TRIM26靶分子的寻找3.1 TRIM26对IRF3报告基因的影响将TRIM26过表达载体转染稳定表达TLR3,TLR4的HEK293细胞之中,以及转染Hela细胞之中,然后用相应的配体进行刺激,分别用LPS和poly(I:C):刺激TLR4,TLR3细胞系,以及SeV感染,ISD转染Hela细胞,利用报告基因方法检测TRIM26对IRF3报告基因的活性水平的影响。3.2 TRIM26对接头分子的影响在HEK293细胞中,转染TRIM26过表达载体以及相应的接头分子：TRIF, MAVS, STING+cGAS和TBK1,提取细胞蛋白,用Western Blotting方法检测TRIM26对IRF3磷酸化的影响。同样,转染TRIM26小干扰后,再用LPS刺激以及SeV感染之后,Western Blotting方法检测TRIM26干扰之后对IRF3磷酸化的影响。为了进一步确定TRIM26的靶分子,在HEK293细胞中,转染TRIM26过表达载体以及IRF3报告基因载体,报告基因方法检测TRIM26对各个接头分子TRIF, RIG-I, MAVS, TBK1和IRF3引起的IRF3报告基因活性的影响,进一步明确TRIM26作用的靶分子。4.TRIM26对靶分子的泛素化及作用4.1 TRIM26与靶分子的相互结合取小鼠的腹腔原代巨噬细胞,用LPS刺激以及SeV感染时间点之后,提取细胞蛋白,利用免疫共沉淀的方法,检测内源性的TRIM26与靶分子之间的相互结合情况。接下来,在HEK293细胞中,转染TRIM26过表达载体与靶分子的过表达载体,共转染24小时后,提取细胞蛋白,利用过表达载体的标签作免疫共沉淀实验,检测外源性TRIM26与靶分子的结合情况。4.2 TRIM26对靶分子的泛素化在HEK293细胞中,转染TRIM26过表达载体,靶分子的过表达载体以及泛素表达载体,共转染24小时后,加入蛋白酶体抑制剂MG132,4小时,收取细胞蛋白,利用免疫共沉淀方法检测靶分子的泛素化水平变化。构建TRIM26的RING结构域的点突变体,如上方法,检测TRIM26的E3连接酶活性突变失活之后,对靶分子的泛素化有何影响。取小鼠的腹腔原代巨噬细胞,转染TRIM26小干扰后,再用LPS刺激以及SeV感染之后,收取细胞蛋白,靶分子作免疫共沉淀,检测TRIM26干扰后,靶分子内源性泛素化的变化。4.3 TRIM26对靶分子的泛素化形式在HEK293细胞中,转染TRIM26过表达载体,靶分子的过表达载体以及野生型泛素表达载体,K48位突变的泛素表达载体以及K63位突变的泛素表达载体共同转染进细胞中,用靶分子的标签抗体作免疫共沉淀,Western Blotting方法检测TRIM26对靶分子存在的泛素化形式。构建靶分子的泛素化位点突变体,如上所述实验方法,检测TRIM26作用于靶分子的泛素化位点。4.4 TRIM26与靶分子相互作用的细胞定位将TRIM26过表达载体与靶分子的过表达载体转染HEK293细胞,24小时后,用LPS刺激,SeV,VSV感染,以及IFN-β刺激相应的时间点,利用免疫荧光检测TRIM26与靶分子相互作用的细胞定位情况。接下来,可以根据上述免疫荧光的结果,构建相应的TRIM26或是靶分子的一系列突变株,利用免疫荧光进一步检测二者的定位变化。5TRIM26抗病毒的生理意义5.1 TRIM26对病毒引起的IFN-β的影响分别取TRIM26转基因鼠和野生鼠的腹腔原代巨噬细胞,用LPS和poly(I:C)刺激或是用SeV和VSV进行感染,分别收取细胞的mRNA以及细胞上清,用RT-PCR方法以及ELISA方法检测TRIM26转基因鼠中IFN-β的mRNA变化以及细胞因子的变化。5.2 TRIM26对病毒复制的影响分别对TRIM26转基因鼠和野生鼠进行VSV滴鼻实验,之后分别取两种老鼠的血清,肝脏以及肺脏,利用ELISA方法检测IFN-β的细胞因子水平,同时取组织肝脏和肺脏的蛋白质,用VSV抗体检测VSV病毒在肝脏和肺脏中的病毒滴度情况。同时,取肺脏组织作HE病理切片染色,检测TRIM26转基因鼠中对肺脏的病理损伤影响。三.实验结果1.病毒感染对TRIM26的调控1.1病毒感染诱导TRIM26的表达取小鼠各组织,利用Western Blotting方法,检测小鼠各组织中的TRIM26蛋白的表达,检测发现在小鼠的肺脏,胸腺,肝脏,脾脏,小肠以及脑组织之中,TRIM26都有大量的表达,但是在心脏和肾脏之中表达较少。用LPS和poly(I:C)刺激小鼠腹腔原代巨噬细胞时,在4小时开始,TRIM26表达开始出现增加,12到16小时时表达达到高峰,在SeV感染小鼠腹腔原代巨噬细胞时,利用Western Blotting方法检测发现TRIM26的表达变化与LPS和poly(I:C)刺激时相似。这说明TRIM26有可能参加到病毒感染引起的信号转导之中。1.2病毒感染引起TRIM26的入核为了明确TRIM26在细胞内的定位,我们构建带GFP荧光标签的TRIM26过表达载体,转染到HEK293细胞,利用免疫荧光技术观察TRIM26在细胞内的定位,发现TRIM26在没有刺激的情况下是定位在细胞质中的。在细胞受到SeVVSV感染8小时时,免疫荧光检测发现TRIM26出现明显的入核现象,同时,用LPS刺激稳定表达TLR4的HEK293细胞时,免疫荧光检测同样发现TRIM26出现明显的核定位现象。综上诉述情况说明TRIM26在病毒感染时会出现明显的细胞核定位现象。2.TRIM26负向调控IFN-β的产生和抗病毒免疫2.1 TRIM26抑制病毒感染引起的IFN-β的产生为了验证TRIM26在抗病毒免疫反应中的作用,我们用报告基因的方法检测TRIM26对众多的PRRs引起的下游的IFN-β表达的影响。在RAW264.7细胞系中,转染TRIM26过表达载体以及IFN-β报告基因载体,培养过夜,之后用LPS和poly(I:C)刺激转染过的RAW264.7细胞系,报告基因检测发现转染了TRIM26过表达载体的RAW264.7细胞系的IFN-β报告基因活性明显变弱。同样方法,利用报告基因方法在稳定表达TLR3,TLR4受体的HEK293细胞中检测TRIM26对IFN-β报告基因的活性水平也是出现了明显的下降。接下来,我们在HEK293以及Hela细胞中,共转染了TRIM26过表达载体以及IFN-β报告基因载体,转染过夜之后,用SeV感染以及poly(I:C)转染进行刺激,转染ISD以及poly(dA:dT)之后,报告基因检测发现TRIM26能明显下调各种刺激引起的IFN-β的报告基因活性。2.2 TRIM26干扰之后对IFN-β产生的影响为了更加直接的研究TRIM26对于IFN-β产生的影响,我们设计了TRIM26的小干扰RNA进行下面的实验。取小鼠的腹腔原代巨噬细胞,利用转染小干扰RNA的方法,将TRIM26相应的干扰RNA转染进巨噬细胞,转染36-48小时之后,用LPS和poly(I:C)刺激,以及SeV感染,ISD转染分别6小时和12小时,ELISA方法检测发现TRIM26被干扰掉之后,IFN-β的产生出现明显的升高。这些结果说明TRIM26对病原微生物尤其是病毒感染之后引起的IFN-β的产生具有抑制作用。2.3 TRIM26的抗病毒影响为了更加直接的研究TRIM26对于机体抗病毒的影响,将TRIM26过表达载体转染Hela细胞,然后用VSV进行感染,RT-PCR检测IFN-β的产生变化以及VSV的mRNA水平的变化。我们发现转染了TRIM26过表达载体的Hela细胞系,产生的IFN-p,相对比于转染了空载体的Hela细胞系来说,IFN-β的表达明显下降,同时VSVmRNA水平在转染了TRIM26过表达载体的细胞系中,出现明显的升高,说明了TRIM26对抗病毒作用具有负向调控作用。接下来,将TRIM26过表达载体或是相应的小干扰RNA转染Hela细胞系,24小时后用VSV感染Hela细胞8小时,收集细胞上清,病毒空斑试验检测发现TRIM26过表达之后,VSV病毒空斑数量明显增多,相似的情况,当用TRIM26小干扰RNA之后,VSV病毒空斑数量出现相应的较少,病毒空斑实验说明了TRIM26对机体的抗病毒反应的负向调控作用。3.TRIM26靶分子是转录因子IRF33.1 TRIM26抑制IRF3报告基因的活性为了研究TRIM26对于IRF3活性的直接作用,设计了以下实验,将TRIM26过表达载体转染稳定表达TLR3,TLR4的HEK293细胞之中,以及转染Hela细胞之中,然后用相应的配体进行刺激,分别用LPS和poly(I:C)刺激TLR4,TLR3细胞系,以及SeV感染,ISD转染Hela细胞,报告基因方法检测发现无论是在293 TLR3,TLR4稳定表达的细胞系还是Hela细胞系之中,配体刺激引起的IRF3报告基因活性在转染了TRIM26过表达载体情况下,IRF3报告基因的活性水平都出现了明显的下降。3.2 TRIM26对接头分子的影响在HEK293细胞中,转染TRIM26过表达载体以及相应的接头分子：TRIF, MAVS, STING+cGAS和TBK1,共转染过夜之后,提取蛋白用Western Blotting方法检测IRF3磷酸化的变化,我们发现转染了过表达载体TRIM26之后,各接头分子引起的IRF3的磷酸化水平都出现了明显的下降。同样,转染TRIM26小干扰36小时之后后,再用LPS刺激以及SeV感染之后,Western Blotting方法检测TRIM26干扰之后,IRF3磷酸化的表达出现相应的升高的情况。IRF3磷酸化水平的检测说明TRIM26对各信号通路都具有抑制作用,说明TRIM26的作用具有共同性,很可能作用在各信号通路的共同存在的接头分子上。为了进一步确定TRIM26的靶分子,在HEK293细胞中,转染TRIM26过表达载体,IRF3报告基因载体以及接头分子TRIF, RIG-I, MAVS,TBK1和IRF3的过表达载体,报告基因方法检测结果表明TRIM26对各个接头分子引起的IRF3报告基因的活性都具有下调作用,这个结果表明TRIM26作用于各信号通路的靶分子很有可能是IRF3。4.TRIM26对靶分子IRF3的K48位泛素化及降解作用4.1 TRIM26与靶分子IRF3相互结合为了研究TRIM26分子对于靶分子的泛素化降解作用,取小鼠的腹腔原代巨噬细胞,用LPS刺激以及SeV感染时间点之后,提取细胞蛋白,用内源性IRF3抗体作免疫共沉淀,Western Blotting方法检测内源性的TRIM26与IRF3之间的相互结合,Co-IP实验表明在LPS刺激,SeV感染情况下,内源性TRIM26与IRF3结合出现明显的增强。接下来,在HEK293细胞中,转染TRIM26过表达载体与IRF3野生形式IRF3WT,磷酸化失活形式IRF35A以及活化形式的IRF35D三种过表达载体,共转染24小时后,提取细胞蛋白,利用IRF3过表达载体的标签作免疫共沉淀,检测发现外源性TRIM26可以与IRF3 WT,5D形式的过表达载体相互结合,而和IRF35A这种磷酸化失活形式的过表达载体没有检测到结合,这说明TRIM26与IRF3的结合需要IRF3的活化。4.2 TRIM26对IRF3进行泛素化因为TRIM26属于E3连接酶TRIM家族中的一员,TRIM26含有一个RING结构域,推测TRIM26很有可能作为一个E3连接酶在信号通路调解中发挥作用。因此,首先我们在HEK293细胞中,转染TRIM26过表达载体,IRF3的过表达载体,共转染24小时后,加入蛋白酶体抑制剂MG132,4小时,收取细胞蛋白,利用IRF3的标签抗体作免疫共沉淀,用泛素抗体作蛋白印迹检测发现加入TRIM26过表达载体后,IRF3的泛素化出现明显的增强。接下来我们构建TRIM26的RING结构域的半胱氨酸16位的单突变体以及半胱氨酸16,36位的双突变体,如上方法,检测发现TRIM26 E3连接酶活性突变后,对靶分子的泛素化出现明显的下降。为了更直接的验证TRIM26对IRF3泛素化的直接作用,我们采用体外泛素化表达体系,对TRIM26的泛素化作用进行验证,通过体外表达体系以及体外泛素化体系验证,我们发现TRIM26可以与IRF3发生直接的结合,并且二者之间存在直接的泛素化作用。为了再进一步明确TRIM26对IRF3的泛素化,我们取小鼠的腹腔原代巨噬细胞,转染TRIM26小干扰后,36小时之后,再用LPS刺激以及SeV感染之后,收取细胞蛋白,用内源性IRF3抗体作免疫共沉淀,检测发现TRIM26干扰后,IRF3内源性泛素化出现明显的下降。4.3 TRIM26对IRF3进行K48位泛素化接下来,为了验证TRIM26对IRF3进行的位泛素化形式,我们在HEK293细胞中,转染TRIM26过表达载体,IRF3的过表达载体以及野生型泛素表达载体,K48位突变的泛素表达载体以及K63位突变的泛素表达载体共同转染进细胞中,用IRF3的标签抗体作免疫共沉淀,Western Blotting方法检测发现TRIM26对IRF3存在K48位的泛素化形式修饰,而对于IRF3的K63位泛素化修饰没有明显的影响。为了进一步确认TRIM26能否促进IRF3的泛素化,我们构建了IRF3的泛素化位点赖氨酸70,87位点的突变体,这两个赖氨酸位点的选择是根据已有文章报道进行的推测,如上所述实验方法,检测发现IRF3的赖氨酸位点70,87位点突变之后,TRIM26对IRF3的泛素化修饰明显下降。以上试验结果说明,TRIM26确是存在对IRF3的泛素化,并且是进行K48位的泛素化而不是K63位的泛素化修饰。4.4 TRIM26与IRF3主要在细胞核内发生相互作用为了确定TRIM26对IRF3泛素化降解作用的细胞定位,我们首先用SeV感染RAW264.7细胞系8小时,之后提取细胞的核蛋白,用内源性的IRF3抗体作免疫共沉淀,western检测TRIM26与IRF3在细胞质核里的相互结合,我们发现TRIM26主要在细胞核之中与IRF3发生相互结合,同时,在SeV感染时,二者的结合出现明显的增强,而在细胞质之中,没有检测明显的结合情况。上述实验发现了二者主要在细胞核中相互结合,那么我们考虑TRIM26发挥泛素化作用是不是也在细胞核之中,提取小鼠的腹腔原代巨噬细胞,转染TRIM26的小干扰RNA,36-48小时之后,用SeV感染8小时,分别提取细胞的质核蛋白,用IRF3抗体做免疫共沉淀,检测发现TRI26干扰之后,主要影响了核内IRF3的泛素化水平,而对细胞质中的IRF3泛素化水平没有明显的影响。为了确定TRIM26是否作用于核内活化形式的IRF3,我们在HEK293细胞中,共转染TRIM26过表达载体的浓度梯度与IRF3 WT,5A,5D三种形式的过表达载体,24小时后,提取蛋白发现随着TRIM26浓度梯度的增加,IRF3 WT,5D的蛋白表达量出现梯度下降的现象,而对IRF35A却没有明显的表达变化的影响。接下来,我们共转染了TRIM26过表达载体与IRF3 WT过表达载体,之后用SeV感染,提取细胞质核蛋白,western分析TRIM26在细胞质以及细胞核之中对IRF3的降解情况, western发现TRIM26主要在细胞核之中对IRF3进行降解,同时SeV感染会促进TRIM26以及IRF3的入核,更进一步说明TRIM26对核内IRF3的泛素化作用。5核转位促进TRIM26对IRF3的降解作用5.1 IRF3的核转位有利于TRIM26发挥降解作用为了明确TRIM26对IRF3泛素化降解确是发生在细胞核之中,我们构建了IRF3 WT,5D的入核信号突变株IRF3KR77/78NG以及5DKR77/78NG,之后与TRIM26共转染, western检测发现TRIM26不能有效的降解IRF3 WT,5D的入核信号突变株IRF3 KR77/78NG以及5D KR77/78NG,这更加说明TRIM26对IRF3的降解很可能是发生在IRF3入核之后。接下来,为了进一步确定TRIM26对IRF3的核内降解作用,构建了IRF3 WT以及5A,5D的出核信突变体IL139/140MM,共转染TRIM26过表达载体之后,提取细胞核蛋白,发现TRIM26能够在核内降解IRF3 WT,5D出核信号突变体,但是不能降解IRF35A的出核信号突变体,以上这些结果表明,IRF3的核转位对于TRIM26的降解作用是非常重要的。5.2 TRIM26核转位促进了IRF3的降解接下来,为了明确TRIM26核转位对IRF3的降解的影响,我们构建了TRIM26的入核信号突变体GFP-TRIM26-M-NLS,首先我们转染这个入核突变体,用免疫荧光的方法验证构建载体的入核情况,从免疫荧光可以看出来,GFP-TRIM26的入核信号突变之后,TRIM26在SeV,VSV感染情况下,入核现象都明显减少,这说明突变效果是成功的。接下来,我们就用GFP-TRIM26-M-NLS与IRF3WT,5A,5D进行共转染,检测TRIM26入核信号突变之后对IRF3的降解的影响,western结果表明,当TRIM26的入核信号突变之后,TRIM26失去了对IRF3WT,5A,5D的降解作用,这个说明TRIM26的入核对于降解IRF3是非常重要的。为了更进一步说明核转位的重要性,我们采用了入核抑制剂Ivermectin,之前有文章报道Ivermectin能有效的抑制转录因子的入核,我们也通过实验验证了Ivermectin发挥作用的浓度与时间,共转染了TRIM26和IRF3后,我们发现在Ivermectin作用下,TRIM26无法降解IRF3,从而说明了核转位对于TRIM26降解IRF3的重要性。6TRIM26抗病毒的生理意义6.1 TRIM26抑制病毒引起的IFN-β的产生前面实验结果已经证实了TRIM26可以通过泛素化降解核内的IRF3负向调控机体的抗病毒免疫,那么TRIM26对于抗病毒具有的生理意义,我们主要是使用TRIM26转基因鼠的模型进行验证。分别取TRIM26转基因鼠和野生鼠的腹腔原代巨噬细胞,用LPS和poly(I:C)刺激或是用SeV和VSV进行感染,刺激或是感染相应时间点之后,分别收取细胞的mRNA以及细胞上清,用RT-PCR方法以及ELISA方法检测发现TRIM26转基因鼠中IFN-β的mRNA水平以及细胞因子的表达在刺激或感染情况下,相比较于野生鼠都出现了明显的下降。6.2 TRIM26对病毒逃逸起到促进作用接下来,我们分别对TRIM26转基因鼠和野生鼠进行VSV滴鼻实验,之后分别取两种老鼠的血清,肝脏以及肺脏,利用ELISA方法检测IFN-β的细胞因子水平,ELISA结果表明,TRIM26转基因鼠组,在VSV感染情况下,无论是血清还是肝脏,肺脏中的IFN-β表达水平都出现了明显的下降,同时取组织肝脏和肺脏的蛋白质,用VSV抗体检测VSV病毒在肝脏和肺脏中的病毒滴度情况发现,转基因鼠组的VSV滴度是明显高于野生鼠组的,肝脏,肺脏的病毒空斑实验也证实了TRIM26转基因鼠组的VSV空斑数是明显高于野生组的。同时,取肺脏组织作HE病理切片染色,从病理切片也可以看出,TRIM26转基因鼠中,病毒感染是比野生组出现严重的现象。最后,我们各取10只转基因鼠和野生鼠,用VSV腹腔注射,观察小鼠的生存曲线,发现TRIM26转基因鼠组的死亡明显快于野生鼠组,且具有统计学意义。这些结果说明TRIM26抑制病毒介导的IFN-p的产生,以及负向调控机体的抗病毒天然免疫。四.结论及创新性1.首次揭示了TRIM26作为E3连接酶在天然免疫中的作用TRIM26作为TRIM家族中的一员,其E3连接酶功能相对于其他家族成员来说,研究的不是很多,尤其是TRIM26在天然免疫中的作用,更是知之甚少,在这里,我们首先研究了TRIM26在抗病毒天然免疫中的作用,无论是在TLR,RLR还是DNA信号通路中,我们都做了详细的验证与说明。我们的研究证实了TRIM26作为一种E3连接酶可以在天然免疫中发挥重要的调控作用。2.首次证实了TRIM26特异性的靶向作用于核内的IRF3IRF3作为机体重要的转录因子,在调控机体的免疫反应中发挥着重要的作用,IRF3的活化需要磷酸化,二聚化以及核转位,之前虽有文章报道过IRF3可以被泛素化降解,但是到目前来说,没有一个明确的研究证实在核内降解活化形式的IRF3,我们的研究证实了TRIM26可以作为E3连接酶,入核之后,在细胞核之中与IRF3相互结合并且可以通过K48位泛素化降解核内活化的IRF3,这在以前是没有被发现过的,我们的研究进一步完善了抗病毒天然免疫的调控机制。3.进一步完善了病毒的逃逸机制病毒感染机体之后,机体会发生固有免疫,进而产生适应性免疫,产生相应的细胞因子以及病毒清除机制,抵抗外界病毒的入侵,同样,病毒自身也会通过各种机制来抵抗机体的各种免疫反应,两种作用相互影响,使机体处于稳定的状态。我们研究发现,病毒感染之后,TRIM26分子的表达出现明显的升高,同时高表达的TRIM26可以降解转录因子IRF3,使IFN-β表达出现下降,从而使病毒更易逃逸,不被机体免疫系统清除,正是由于存在负向调控的机制,才不至于使机体产生过量的IFN-β和细胞因子,产生自身免疫疾病,使机体处于稳定的状态。4.为临床抗病毒药物的研发提供了新的思路病毒感染是全世界都面临的一个非常棘手的问题,通过我们的研究,或许可以为临床上治疗一些疾病提供治疗上的一些帮助,而且TRIM26可以作为药物治疗的靶点,应用于临床疾病的诊疗之中。