肾母细胞瘤是小儿最常见的恶性实体肿瘤,在小儿外科疾病中占重要的地位。但是,至今肾母细胞瘤发生发展的分子学机制仍然不明确。因此,深入探索肾母细胞瘤的发病机理,对寻找新的治疗方法和提高患儿的生存率,具有重要的临床价值和意义。Stat3(Signal transducer and activator of transcription protein 3,Stat3)作为信号转导子与转录激活子家族的重要成员与多种肿瘤的发生发展有着密切的联系,但Stat3在肾母细胞瘤中的作用及其机制目前知之甚少。本研究通过对肾母细胞瘤肿瘤标本和肿瘤细胞的系统研究,探讨Stat3在肾母细胞瘤发生发展中的调节作用,并进一步阐明Stat3对肾母细胞瘤的作用机制,以期为肾母细胞瘤的生物治疗提供一个新的靶点。第一部分Stat3在肾母细胞瘤肿瘤组织中的表达及其对肿瘤细胞活力和增殖的影响目的:检测Stat3在肾母细胞瘤组织标本中的表达,并观察Stat3对肾母细胞瘤细胞株G401细胞活力和增殖的影响,以了解Stat3信号通路在人肾母细胞瘤发生发展过程中所起的作用。方法:将22例肾母细胞瘤肿瘤组织及其瘤旁组织行定量PCR和Western blot,以测定Stat3的表达量。在G401细胞中以IL-6诱导Stat3活化或将CA-Stat3真核表达质粒经脂质体介导转染G401细胞,然后运用MTT实验和Brd U实验检测G401细胞活力和增殖情况。反之,以针对Stat3的si RNAs阻断Stat3信号通路,然后运用MTT实验和Brd U实验检测G401细胞活力和增殖情况。结果:Stat3 m RNA和蛋白在所有肿瘤组织中的表达率为100%,并且比瘤旁正常组织高表达(P<0.05)。在G401细胞中以IL-6诱导Stat3活化或将CA-Stat3真核表达质粒经脂质体介导转染G401细胞后,细胞内Stat3高表达,肿瘤细胞活力和增殖能力增强(P<0.05)。反之,以针对Stat3的si RNA阻断Stat3信号通路后,细胞内Stat3受抑制,肿瘤细胞活力和增殖能力降低(P<0.05)。结论:Stat3在人肾母细胞瘤中有广泛的表达,Stat3与肾母细胞瘤细胞株的活力和增殖等诸多方面均有密切联系。第二部分肾母细胞瘤中Stat3转录调控mi R-370的表达目的:探讨在肾母细胞瘤中Stat3对mi R-370的转录调控作用及其分子机制。方法:以IL-6诱导活化G401细胞中的Stat3,然后利用mi RNAs芯片筛选差异性mi RNAs。利用生物信息学方法预测启动子区域含有Stat3结合位点的差异性mi RNA。在G401细胞中以IL-6诱导Stat3活化或将CA-Stat3真核表达质粒经脂质体介导转染G401细胞使Stat3过表达,反之,以针对Stat3的si RNA阻断Stat3信号通路,然后运用定量PCR测定mi R-370的表达。将22例肾母细胞瘤肿瘤组织及其瘤旁组织行定量PCR以测定mi R-370的表达,并分析Stat3和mi R-370表达间的相关性。应用荧光素酶报告实验、染色体免疫共沉淀技术验证肾母细胞瘤中Stat3转录调控mi R-370表达的分子机制。结果:选择差异倍数三倍以上、P值<0.05的差异表达mi RNAs进行聚类分析。在Stat3经IL-6诱导活化的G401细胞中,表达上调的mi RNAs共5个,表达下调的mi RNA共4个。生物信息学方法预测发现mi R-370编码基因启动子区域有Stat3的结合位点。在G401细胞中以IL-6诱导Stat3活化或将CA-Stat3真核表达质粒经脂质体介导转染G401细胞使Stat3过表达,定量PCR检测发现mi R-370的表达增高。反之,以针对Stat3的si RNA阻断Stat3信号通路,定量PCR检测发现mi R-370的表达降低。将22例肾母细胞瘤肿瘤组织及其瘤旁组织行定量PCR,结果表达mi R-370在肾母细胞瘤肿瘤组织中高表达并且与Stat3的表达呈正相关。在G401细胞中将CAStat3和报告质粒PGL4-370.WT共转染后,进行荧光素酶基因报告实验,结果发现G401细胞中Stat3高表达后,报告质粒PGL4-370.WT的荧光活性增强(P<0.05),表明Stat3能够靶定mi R-370,在转录水平调控其表达。在G401细胞中以IL-6诱导活化Stat3或以si RNAs沉默Stat3后进行Ch IP-PCR,结果显示mi R-370的引物能使Stat3组扩增较对照组明显增加(P<0.05)或下降(P<0.05),Stat3能与编码mi R-370的DNA片段在其启动子区域结合而调控mi R-370的转录。结论:Mi R-370在肾母细胞瘤肿瘤组织中高表达,并且与stat3的表达呈正相关。Mi R-370是Stat3潜在的靶基因,Stat3在转录水平对mi R-370进行调控。第三部分mi R-370对肾母细胞瘤细胞活力和增殖的影响及其机制目的:分析mi R-370在肾母细胞瘤发生发展中的作用,预测及鉴定mi R-370的靶基因,明确其对肾母细胞瘤细胞活力和增殖的影响。方法:在G401细胞中以mi R-370模拟物(mi R-370 mimic)或mi R-370抑制物(mi R-370 inhibitor)将mi R-370过表达或沉默后,运用MTT实验和Brd U实验检测G401细胞活力和增殖,流式细胞术观察细胞周期分布情况;同时,运用Western blot检测细胞周期相关蛋白的表达情况。利用生物信息学方法对mi R-370的靶基因进行预测,并应用DAVID数据库进行mi R-370靶基因的功能富集分析和信号转导通路富集分析。然后,应用荧光素酶报告基因系统分析mi R-370与其潜在靶基因WTX相互作用的机制。在G401细胞中以mi R-370 mimic或mi R-370 inhibitor将mi R-370过表达或沉默后,采用定量PCR和Western blot在转录和翻译水平评判mi R-370对WTX的调控作用。最后,在G401细胞中以si RNAs靶向沉默WTX后,运用MTT实验和Brd U实验检测G401细胞活力和增殖情况。结果:G401细胞转染mi R-370 mimic后,MTT实验和BrdU实验显示细胞活力和增殖增强(P<0.05);FCM检测发现处于S期的细胞增多(P<0.05);Western blot显示能够阻止细胞通过G1/S期限制点而进入S期的p21和p27蛋白表达降低、而促使细胞从G1期进入S期的Cyclin D1蛋白表达增多。反之,G401细胞转染mi R-370inhibitor后,上述实验检测发现细胞活力和增殖降低(P<0.05)、处于S期的细胞减少(P<0.05)、p21和p27蛋白表达增多、Cyclin D1蛋白表达减少。生物信息学预测WTX为mi R-370的靶基因,荧光素酶基因报告实验证实mi R-370可通过WTX的3’-UTR区域抑制WTX的转录(P<0.05)。DAVID数据库对靶基因功能富集分析和信号转导通路富集分析提示mi R-370可调控细胞周期。Si RNA靶向沉默WTX后细胞活力和增殖增强(P<0.05),说明对WTX进行RNA干扰,能够取得与过表达mi R-370一致的生物学效应,证明mi R-370能够通过抑制WTX影响肾母细胞瘤细胞活力和增殖。结论:mi R-370通过抑制靶基因WTX提高肾母细胞瘤细胞活力、促进细胞增殖、调控细胞周期分布。由此可见,mi R-370在Stat3的转录调控下通过WTX促进肾母细胞瘤细胞增殖。深入探讨Stat3/mi R-370/WTX调节轴在肾母细胞瘤发生发展中的作用,不仅能够深化我们对肾母细胞瘤的认识,也将有助于确定Stat3和mi R-370是否具有作为肾母细胞瘤治疗的新靶点的潜力。