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DNA和RNA都是遗传物质,人们对于DNA的复制机制已经有了比较透彻的了解,但对RNA的复制还不清楚。RNA的复制为病毒所特有,利用正链RNA病毒开展有关RNA复制的研究在分子生物学和遗传学基本理论方面具有重要意义,同时也可以加强对RNA病毒的认识,并为抗病毒治疗提供新的策略。 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是一种具囊膜的正链RNA病毒,基因组长约9.6kb,由5’编码区、3’编码区和一个大的开放阅读框架(ORF)组成。ORF编码一个约3000氨基酸残基组成的多聚蛋白前体,经宿主蛋白酶和HCV编码的蛋白酶切割后产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白,其中非结构蛋白NS5B具有依赖于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)活性,是HCV基因组复制的关键酶。HCV的基因组复制和其它正链RNA病毒类似,先以正链RNA为模板合成出互补的负链RNA,然后再以新合成的负链RNA为模板合成子代正链RNA,因此一致认为HCV正链RNA和负链RNA的3’端序列在起始病毒基因组复制的RNA合成中起重要作用。HCV在基因组复制时出现不对称复制:产生的正链RNA数量比负链RNA多得多,前者是后者的10—100倍,这一现象表明HCV基因组复制时对HCV正、负链RNA模板的选择性是非常强的。目前尚不清楚模板选择性的机制。本论文利用纯化的HCV NS5B蛋白以及HCV正链、负链3’末端RNA,在体外条件下研究NS5B利用两种模板进行RNA合成的情况,以探讨HCV基因组模板选择性的机制。 将HCV NS5B基因克隆至原核表达载体pET-His,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。为提高蛋白的可溶性表达,将NS5B C末端疏水性的21个氨基酸缺失,在一定的培养条件下,经过IPTG诱导获得可溶性蛋白。进一步通过组氨酸亲合层析获得纯化的蛋白,经Western blot检测确定是HCV NS5B蛋白。 把对应于HCV正、负链RNA3’末端序列的DNA序列克隆至体外转录质粒pGEM3Zf(+),通过体外转录制备HCV正链、负链3’末端RNA,分别作为RNA模板进行RdRp反应,用Northern blot和RT-PCR检测产物合成情况,结果没有检测到以正链RNA为模板的负链RNA产物,而以负链RNA为模板,可以合成一条全长的正链RNA产物;进一步将两种模板混合,进行模板竞争性实验,正链RNA模