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宫颈癌是女性第二大常见的恶性肿瘤,在所有恶性肿瘤中,宫颈癌的发病因素最为明确,高危人乳头瘤病毒(HPV)癌基因E6、E7的过表达是关键和必要的致病因素。HPV16是宫颈癌发病相关最常见的基因型,占所有基因型的50%以上。RNA干扰(RNAi)是近年发展起来的一种有效的基因沉默新技术,其独特的优势超过了其他所有基因沉默技术。目前对RNAi研究主要有转录后水平的沉默和转录水平的基因沉默两个方面。而目前RNAi在宫颈癌上的研究基本集中在HPV E6/E7转录后水平的基因沉默。但由于病毒特有变异能力,探索多个途径基因沉默的研究非常重要。HPV16癌基因E6和E7具有共同的启动子,为RNAi在转录水平同时沉默E6和E7转录提供了可行性,本课题组已经研究了靶向启动子区的体外实验,但迄今尚未见利用RNAi对HPV病毒基因在转录水平沉默的体内研究报道。本研究拟以含HPV16的宫颈癌细胞株SiHa为研究对象,合成靶向HPV16E6和E7共同启动子的siRNA,以及直接靶向E7的siRNA,将它们分别转入SiHa细胞中,观察癌基因E6、E7的表达情况和细胞的生长情况。进一步以宫颈癌荷瘤动物模型为研究对象,通过用转染siRNA的细胞荷瘤和对野生型细胞荷瘤后再注射siRNA两种方法,检测肿瘤生长情况及病理变化,观察siRNA在实验动物模型中的疗效。旨在探索两种途径的基因沉默在体内外抑制宫颈癌SiHa细胞生长作用,为宫颈癌防治的临床应用打下基础。第一部分靶向HPV16E6/E7共同启动子的siRNA抑制宫颈癌SiHa细胞生长作用的体外研究目的：证实靶向HPV16E6/E7启动子区的siRNA在体外可以抑制宫颈癌SiHa细胞的生长。方法：选择靶向HPV16E6/E7启动子区和E7编码区的siRNA,并将两种siRNA分别导入宫颈癌细胞株SiHa中,观察癌基因E6和E7表达情况,及细胞的增殖和凋亡情况。结果：在体外水平,靶向HPV16E6/E7启动子区和E7编码区的siRNAs均在mRNA水平有效抑制了SiHa细胞E6/E7的表达；在蛋白水平,作为替代的下游靶分子P53分别上调了199%和577%,P16下调了49.5%和44.7%；细胞增殖分别被抑制29.29%和26.19%；细胞凋亡分别提高了161.54%和124.62%。结论：靶向HPV16启动子区的siRNA可以有效、同步沉默病毒基因E6和E7,并抑制细胞增殖和诱导其凋亡。第二部分靶向HPV16E6/E7共同启动子的siRNA抑制宫颈癌移植瘤生长的研究目的：确定靶向HPV16E6/E7启动子区的siRNA能抑制宫颈癌SiHa细胞荷瘤鼠体内移植瘤的生长。方法：在裸鼠体内水平,我们设计了两套实验流程,即将siRNA转染后的SiHa注射到BALB/c裸鼠皮下,以及将SiHa直接注射到裸鼠皮下荷瘤然后在瘤内注射siRNA混合制剂,观察肿瘤生长抑制情况,随后将离体的瘤体标本进一步做HE染色,抗Ki-67抗体染色以及TUNEL法检测瘤组织的增殖和凋亡情况。结果：1.在干扰后荷瘤实验中,80天后,靶向启动子区和E7编码区的实验组的裸鼠的瘤体积和瘤重均明显小于对照组,瘤体积分别下降了89.7%和64%,瘤重分别轻了4.59倍和2.6倍。2.荷瘤后注射靶向启动子区和E7编码区的siRNA后,裸鼠的瘤体积和瘤重均明显小于对照组,瘤体积分别下降了29.8%和42.8%,瘤重分别轻了1.65倍和1.45倍。3.无论是干扰后荷瘤,还是荷瘤后注射siRNA的瘤体组织标本检查结果显示各组Ki-67均没有差异,而各组凋亡却都出现显著差异。结论：1.靶向HPV16E6/E7启动子区的siRNA能有效抑制宫颈癌荷瘤鼠体内移植瘤的生长。2.靶向HPV16E6/E7启动子区的siRNA对移植瘤的体内抑制作用主要是通过诱导细胞凋亡来实现。