吡咯里西啶生物碱(pyrrolizidine alkaloids,PAs)是一类天然的生物碱,多数具有明显的肝脏毒性,通常又称之为肝毒性吡咯里西啶生物碱(hepatotoxic pyrrolizidine alkaloids,HPAs)。已发现400多个不同结构的PAs,广泛存在于世界各地的6,000多种有花植物中,特别是菊科、豆科、紫草科等植物中。因服用含PAs的传统草药或间接的食物污染等会导致人畜中毒甚至死亡,目前对各种含有PAs的药物或食品的使用在世界上引起广泛的重视。建立药材及制剂中PAs的快速、灵敏和准确的分析方法(定性、定量),对于保障临床用药的安全具有重要意义。 本论文围绕HPAs的检测,利用多种现代分析技术,如高效液相色谱法、柱前衍生化-高效液相色谱联用、质谱及液相质谱联用、1H-核磁共振波谱法等,对PAs进行分析方法的研究与应用。内容主要包括:HPAs定性分析方法的研究；HPAs定量分析方法的研究；千里光属八种植物中PAs的分布：不同产地千里光中RET-PAs总碱及单一PA的含量测定；大环不饱和PAs总碱的含量测定等。此外,利用液相质谱联用,还对isoline大鼠体内的代谢产物进行检测与分析,并探索龙胆苦甙对其代谢的影响。 1.RET-PAs的高效液相色谱分析 建立千里光中adonifoline的高效液相色谱分析方法。对RET-PAs的高效液相色谱条件进行了考察,包括流动相中有机相的选择、水相的组成、流动相的pH、色谱柱的适用性、UV检测波长、及进样体积等。结果显示,流动相的pH值、进样体积、检测波长对RET-PAs的色谱分离有较大的影响。其中,流动相的pH值最为重要,直接影响PAs的色谱峰形、柱效及检测灵敏度。最终确定色谱条件为:Agilent Extend C-18色谱柱(250×4.6 mm,5μm);流动相为乙腈：甲酸-三乙胺-水溶液(0.01-0.05-500);梯度洗脱,流速为1 mL/min;柱温为25℃:UV为223 nm;进样体积为10μL。PAs的LODs普遍在1 μg/mL左右。对千里光中adonifoline的分析结果显示,末端检测下杂质干扰很大,LOQ在10 μg/mL以上。HPLC不适用于千里光中PAs的定量分析,只可作为定性检测方法。 2.RET-PAs的柱前衍生化-高效液相色谱分析 建立柱前衍生化-高效液相色谱测定RET-PAs总碱含量的分析方法,并运用于千里光中RET-PAs总碱含量的检测。RET-PAs可与四氯苯醌和Ehrlichs试剂(4-二甲氨基苯甲醛,三氟化硼)发生专属性反应,生成在560 nm下具有强吸收的紫色产物。通过高效液相色谱、质谱、核磁共振等技术,阐明了该反应的发生机理,解析了产物的具体结构,并确定衍生化反应条件为:RET-PAs氯仿溶液1 mL先后加入1％四氯苯醌5 μL及2％Ehrlichs试剂50μL,室温条件下,密闭反应4 h,HPLC检测。色谱条件为:Varian polaris C18-A色谱柱(250×4.6mm,5 μm);流动相为乙腈：1％甲酸(35:65);等度洗脱,流速为1 mL/min;柱温为25℃；UV/VIS为560 nm;进样体积为10μL。方法的LOD为0.26 nmol/mL,LOQ为0.79 nmol/mL。通过方法学评价,柱前衍生化.高效液相色谱法运用于13个产地千里光中RET-PAs总碱的含量测定。结果表明,因产地的不同,RET-PAs的含量有很大差异。 3.PAs的液相质谱联用分析 建立四种结构类型PAs适用的液相质谱联用定性分析方法,并运用于千里光属植物中PAs的检测。在直接进样的方式下,研究PAs电喷雾质谱的裂解规律。结果显示,四种结构类型的PAs均有其共有的标志性碎片离子,如RET-PAs的特征离子为m/z 120和138;RET-PAs-N-O的特征离子为m/z 118、119、120、136、137和138;1,2-saturated RET-PAs的特征离子为m/z 122和140;OTO-PAs的特征离子为m/z 150和168。将质谱与高效液相色谱联用,对千里光属8种植物中PAs分布状况进行检测。色谱条件为:TOSOH TSK-GELODS-100S色谱柱(250×2.0 mm,5μm);流动相为乙腈和0.2％甲酸水溶液；梯度洗脱,流速为0.2 mL/min;柱温为25℃；进样量为2μL。方法的LOD为1 ng/mL。八种植物检测到PAs共300个。其中,RET-PAs有123个,RET-PAs-N-O有37个,1,2-saturated RET-PAs有86个,OTO-PAs有54个,PAs在植物种间的分布差异较大。 通过方法学评价,系统地建立对单一生物碱adonifoline的液相质谱联用定量分析方法,并用于13个不同产地千里光及千里光不同部位中adonifoline的含量测定。色谱条件为：TOSOH TSK-GEL ODS-100S色谱柱(250×2.0 mm,5μm);流动相为乙腈和1％甲酸水溶液；梯度沈脱,流速为0.8 mL/min,柱后分流,以0.08 mL/min流速引入ESI离子源；柱温为25℃；进样量为3μL。方法的LOD为1 ng/mL,LOQ为5 ng/mL。13个产地千里光中adonifoline检测结果表明,因产地的不同,adonifoline含量有很大差异。结果与之前相同千里光中RET-PAs总碱分析数据相比,显示出良好的相关性。对千里光不同部位的检测结果显示,adonifoline在花中的含量最高,在叶中的含量最低。 4.大环不饱和PAs的1H-核磁共振波谱分析 尝试建立大环不饱和PAs总碱含量的1H-核磁共振波谱测定方法,以对-二硝基苯为内标,分析药用植物中大环不饱和PAs总碱的含量。通过内标法,1H-NMR谱中不饱和PAs特征信号(C-2位烯基质子的化学位移)与浓度具有良好的线性关系,可以用于大环不饱和PAs的含量测定。在此基础上,对橐吾属及千里光属七种药用植物中大环不饱和PAs总碱进行检测。1H-NMR数据显示,PAs含量低的千里光属植物,特征信号很弱,伴有明显的杂质干扰。而PAs含量较高的橐吾属植物,特征信号较强,但出现多个信号峰,可能是necine acid环上烯基质子的化学位移,也可能是多个PAs结构不同引起2位烯基质子化学位移差异,或样品中杂质的干扰。结果表明,对于体系复杂的样品,1H-核磁共振波谱分析不适用于大环不饱和PAs总碱的定量分析。 5.Isoline大鼠体内代谢产物的研究 利用液相质谱联用技术,研究isoline在大鼠体内的代谢产物分布情况。推测isoline在大鼠体内代谢途径,及龙胆苦甙对其代谢的影响。经检测发现,大鼠体内isoline代谢产物共41个。其中,胆汁中有34个,尿液中有30个。龙胆苦甙对isoline在大鼠体内的代谢产物无显著影响,代谢产物相同,代谢途径均以酯水解和N-氧化两种方式为主。但在龙胆苦甙的影响下,代谢产物的分布速率显现出减缓的趋势,可能表明大鼠对isoline代谢能力的下降。 通过上述研究,为肝毒吡咯里西啶生物碱检测提供了多个有效的定性定量分析方法,建立较为全面的HPAs分析平台,以满足针对HPAs的各类型样品及不同分析目的的需要,特别是药用植物中HPAs的监测。在实际运用中,可根据样品的性质和分析目的,选择适当的仪器和方法,实现对HPAs有效的检测与分析。