分枝杆菌是抗酸杆菌的一种,其包括结核杆菌、麻风杆菌、非结核型分枝杆菌。分枝杆菌感染病的发生是分枝杆菌与宿主免疫共同作用的结局,然而宿主针对分枝杆菌感染的免疫防御机制尚未完全清楚。分枝杆菌进入宿主机体后可于局部形成特征性病理学结构-肉芽肿,肉芽肿的免疫作用尚存在争议。目前普通的动物模型如鼠等与人类的免疫反应尚有差异,应用人类细胞的体外实验可克服该问题,但目前研究多使用不同型的分枝杆菌刺激单一效应细胞的方法观察免疫相关因素的变化。方法虽然较为简单,研究条件因素易控制,但仅采用一种人类细胞仍不可模拟出局部肉芽肿结构中的复杂的细胞构成,与人体的免疫反应仍差别较大。因此本研究第一部分即建立更接近于人体内分枝杆菌感染的实际病理过程的体外模拟结构并应用该模拟结构来探索几种常见分枝杆菌诱导有效免疫反应的能力,最终初步筛选出候选治疗性疫苗。第一节即基于肉芽肿的己知结构,将人的巨噬细胞、单一核细胞及菌进行体外共培养,尽可能的模拟肉芽肿结构中的细胞构成,使体外研究更接近于人体内的实际病理过程；按照常见的四种分枝杆菌各自的特性,调整感染复数值及培养的温度等因素,从而建立一种新型的分枝杆菌肉芽肿体外模拟结构。在共培养的过程中通过显微镜观察、细胞染色证实分枝杆菌肉芽肿样结构的形成；检测巨噬细胞表面抗原的存在验证其激活巨噬细胞的能力；测定与Th1及Th2型免疫反应相关的重要细胞因子的mRNA表达及分泌水平,探索该模拟结构中菌刺激免疫反应的能力。结果发现培养7-9天后观察到与肉芽肿结构相似的细胞聚集团块,细胞团块中出现多核巨细胞；CD14、CD68、CD86等细胞表面抗原在不同分枝杆菌刺激组的细胞中均有阳性表达；重要细胞因子TNF-a、IFN-γ、IL-1β、IL-10亦有不同程度的mRNA表达及分泌。第二节将建成的分枝杆菌肉芽肿体外模拟结构应用于检测海鱼分枝杆菌诱导免疫反应的能力,并与卡介苗及结核减毒菌株相比较,从菌及宿主免疫两方面,肉芽肿形成、多核巨细胞形成、巨噬细胞表面抗原表达、重要细胞因子mRNA表达及分泌水平、趋化因子的mRNA表达水平、菌活力变化等多种因素上观察不同分枝杆菌的免疫诱导能力的差异。结果发现海鱼菌实验组细胞在培养过程中可表达更高水平的IL-1B、IL-12p40及CXCL8、CXCL10、XCL1同样,可分泌出更多的TNF-α、IL-1β、IL-10,而提示海鱼菌在诱导Thl型及Th2型免疫反应方面可能较另两种菌更强；此外海鱼菌组的海鱼菌菌落数亦较另两种菌明显较低,提示海鱼分枝杆菌有潜力成为安全、有效的治疗性疫苗候选物。目前用于分枝杆菌感染的有12种疫苗处于临床试验不同阶段,其可分为两种,改善的完整分枝杆菌为主的微生物疫苗及亚基增强疫苗。然而,研究显示这些疫苗虽可调节免疫、降低细菌载量,但是并不能彻底消除感染。因此,治疗性疫苗多为在抗菌治疗基础上的辅助治疗,而其适应症人群多为传统抗菌治疗困难的病例,如存在耐药、抗菌药物副作用(尤其过敏)的病例等。了解上述适应症人群的流行病学特征可为探索治疗性疫苗的研究必要性提供基础,目前结核病的相关研究己基本完善,而麻风病中的上述适应症人群在中国的分布情况尚不详。因此,本研究第二部分即针对两项可导致麻风抗菌药物治疗困难的重要因素(耐药及过敏),在全国范围内行流行病学调查,观察这两项因素在中国的麻风病人群中的发生比率,警惕专业人员对其提高重视。第一节收集2010-2011年度我国的复发及治疗抵抗的麻风患者的基本资料及皮肤标本,PCR扩增菌DNA中与氨苯砜、利福平、氧氟沙星耐药相关的folP1、rpoB、gyrA的3个目的基因片段,测序比对得出不同病人标本中耐药相关序列突变位点,得出中国该年度复发及治疗抵抗的麻风患者皮损中针对三种常规抗菌药物的耐药菌株数,并分析病人相关的临床资料。研究发现2例治疗抵抗患者及1例复发患者中存在folP1片段点突变；另1例复发患者rpoB片段有错义突变；并未发现gyrA片段耐药相关的错义突变。第二节即监测2006-2009年全国麻风病人,按照制订的氨苯砜高敏感综合征诊断标准,观察氨苯砜高敏感综合征病人的发病率,同时收集这些病人的临床资料行统计分析,从发病率、基本特征、临床特征、治疗方案等各方面加强对中国氨苯砜高敏感综合征病人的了解。研究发现四年间,中国仅17个麻风高发省上报了126例疑似氨苯砜高敏感综合征病例,最终有63例病人诊断为氨苯砜高敏感综合征(13例为完全型)并行流行病学分析(平均发病率为1%)。所有病人均在联合化疗开始后14天至2月出现症状；不同病人的临床表现各异,主要的临床表现多集中于皮肤及肝脏；氨苯砜高敏感综合征病程为2-8周,平均38.1天；7例病人(11.1%)因该综合征死亡。目前,本课题在建立分枝杆菌肉芽肿体外模拟结构的基础上,通过探索不同分枝杆菌诱导免疫反应的能力,发现海鱼分枝杆菌更强的对Th1型及Th2型免疫反应的诱导能力,提示其可作为治疗性疫苗的候选物。而治疗性疫苗理论上多作为抗菌治疗的辅助方法,尤其适用于抗菌治疗困难的病例,本课题后期亦进行了治疗性疫苗适应症人群的流行病学调查研究,用以论证用于麻风病等分枝杆菌感染的治疗性疫苗进一步深化研究的重要性和必要性,更为将来对本研究获得的具有应用前景的治疗性疫苗候选物的转化研究提供必要的临床需求性依据。