镉是世界上最毒的重金属之一。由于工、农业的发展等因素,自然环境,包括水生态受到严重的镉污染。镉在生物细胞内不被降解,半衰期长,能在各组织累积,并造成极大的损伤。本研究以中国目前常用的环境毒理学研究实验动物稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)性成熟雌鱼为对象,运用组织学、组织化学、透射电镜技术、生理学、分子生物学、转录组学等研究手段和方法,研究水体急、慢性镉暴露对稀有鮈鲫肝脏的形态结构、肝细胞的细胞器、脂滴数量和沉积、有关代谢的生理生化指标、脂滴形成相关基因的表达、有关脂代谢激素及信号通路影响;结合转录组学,分析潜在的机制。其中第一部分实验内容研究了水体2.0 mg/L镉暴露0-96h,2.5、2.8 mg/L镉暴露96 h以及0、5、25、50、75、100μg/L镉暴露5w和12w对实验鱼肝脏的形态结构、细胞器的影响,以及肝组织脂滴沉积情况,以探讨水体镉暴露对稀有鮈鲫的生长和肝脏组织的损伤情况。第二部分实验克隆了稀有鮈鲫自噬相关基因Beclin1的全长cDNA序列,进行了生物信息学分析,检测了该基因的时空表达模式,并研究了该基因在水体急、慢性镉暴露后的各组织中的表达情况,以初步判断镉暴露与自噬的关系。第三部分实验检测了急、慢性镉暴露后稀有鮈鲫血清生理生化指标以及有关脂滴形成、脂质转运和氧化相关基因的表达,以解释脂滴增多原因。第四部分实验检测了急、慢性水体镉暴露对应激和代谢都有重要调节作用的H-P-I轴的激素含量以及信号通路相关的基因的表达水平,探讨了稀有鮈鲫响应于镉暴露的应激反应。第五部分实验通过转录组分析,研究了水体75μg/L镉暴露5w后稀有鮈鲫差异表达的基因,并检测脂代谢相关基因在其它的急、慢性镉暴露样本的表达情况,结合血清GH家族激素以及血清炎症因子的含量和表达,从而分析镉导致的稀有鮈鲫生长干扰、脂代谢紊乱的潜在机制。主要研究结果:1)0-100μg/L镉暴露5w后稀有鮈鲫的死亡率分别为2.56%,0%,27.91%,37.5%,57.5%,68.18%;75μg/L及以上浓度组稀有鮈鲫肥满度系数显著(P<0.05)降低;25μg/L镉暴露12周后实验鱼体重、空壳重、内脏团重显著(P<0.05)降低。2)水体2.0-2.8 mg/L急性镉暴露都会造成肝脏组织严重的损伤,形态上主要表现为细胞肿胀或皱缩、空泡化;5μg/L慢性镉暴露对稀有鮈鲫肝脏形态上无明显影响,25μg/L及以上浓度组实验鱼肝组织内出现不同大小的空泡结构,100μg/L浓度组细胞受损最严重。50和75μg/l浓度组肝脏严重变形,有多个肿瘤。5-100μg/l慢性镉暴露导致稀有鮈鲫肝细胞内不同程度脂滴沉积,无剂量依赖效应。3)急性镉暴露不同时间,表现出不同病理特征。总体上看,稀有鮈鲫肝细胞表现出糖原减少、细胞器坏死、髓样小体增多、粗面内质网(rer)异常增生或减少、线粒体肿胀、桥粒连接打开、枯否氏细胞增多、细胞坏死、细胞膜损伤、红细胞浸润等现象。急性镉暴露72h-96h,肝细胞内脂滴增多,并首次观察到镉诱导的细胞核脂滴。慢性镉暴露后亚显微水平的变化与急性镉暴露相似:肝细胞肿胀,糖原消失、自噬小体增多,低浓度组rer增生,高浓度组滑面内质网(ser)增生,细胞膜消失或细胞间隙增大,细胞内有脂滴沉积。首次观察到镉诱导的rer同心圆小体和指纹状板层小体。4)稀有鮈鲫的beclin1基因全长cdna序列1940bp,与其它鱼类及高等脊椎动物有高度相似性;该基因编码的由447个氨基酸残基组成的蛋白,含bh3、ccd、ecd结构域,但ccd短于人和啮齿类的长度。水体急性镉暴露后,beclin1基因在鳃、肠显著(p<0.05)升高,脑组织降低;水体慢性镉暴露后,在脑组织显著(p<0.05)上升,但在肝脏显著(p<0.05)降低;beclin1在幼鱼响应于5-100μg/l水体镉暴露的表达变化具有时间和剂量依赖性效应。5)水体2.0mg/l镉暴露后,稀有鮈鲫血清中hdl-c、t-cho、tg、atp含量升高;肝脏hdl-c、t-cho、tg、ldh和乳酸含量升高,cs酶活性降低;慢性镉暴露后,hdl-c、t-cho、tg血清含量呈降低趋势,肝脏内tg显著降低,但100μg/l组实验鱼肝脏t-cho升高。6)与组织学所观察到的肝细胞内的脂滴沉积现象相呼应:负责脂质回肝的hdl-c的主要蛋白成员apoai基因,脂滴形成相关基因plin2、cav2、cpti、cptii,脂质代谢相关基因pparr在急性2.0mg/l镉暴露96h稀有鮈鲫肝脏显著(p<0.05)升高;负责脂质出肝的ldl-c主要蛋白成员apob-100基因却显著(p<0.05)降低。慢性镉暴露5w后,血清中各种脂质成分含量降低,但100μg/l镉浓度组鱼肝脏t-cho含量升高;相关基因仅有cptii基因在100μg/l浓度组实验鱼显著(p<0.05)升高。7)急性镉暴露对稀有鮈鲫血清msh、cortisol含量有显著影响。cortisol合成关键基因star、cyp11a1、cyp11b1表达量显著(p<0.05)升高。cortisol代谢关键基因11β-hsd2在多种组织表达量上升,其在肾脏组织的酶活性含量也升高。cortisol受体gr在鳃、肠、肌肉的表达显著(p<0.05)降低,gr调节基因fkbp5在鳃和肠表达显著(p<0.05)上升。h-p-i轴的crh、acth含量无显著变化,相关基因crh、pomc、crhr、mc2r基因在脑或肾脏的表达不受到镉暴露的显著影响。50μg/l以上浓度镉暴露5w,稀有鮈鲫血清crh、acth、msh、cortisol都显著(p<0.05)升高,100μg/l组实验鱼crh、mc2r、star、cyp11a1、cyp11b1表达量显著(p<0.05)升高,gr表达无显著变化,但fkbp5在鳃和肠显著(p<0.05)升高。8)稀有鮈鲫肝脏中表达量最高的60个基因可分为脂质代谢、消化酶、繁殖、铁或钙离子转运、呼吸链和凝血、先天免疫和应激反应、蛋白合成与降解七类。75μg/l镉暴露后,稀有鮈鲫肝脏组织筛选出288个差异表达基因,其中192个下调。运用rt-qpcr验证了部分基因的表达。9)水体75μg/l镉暴露5w后,从肝脏组织筛选出差异表达基因,其中51个与离子结合相关,27个与锌离子有关,8个分别与铁和钙离子有关;33个与脂质消化吸收和代谢相关,包括SCD,PEPC等;与氧化应激相关的18个;与生长相关的基因11个,包括IGF1。10)镉暴露造成编码GH家族激素基因合成和分泌紊乱;血清炎症因子含量发生显著变化。VtgAO1和SCD基因在慢性镉暴露所有浓度组和急性镉暴露的所有时间点都显著(P<0.05)降低。主要研究结论:1)水体慢性镉暴露导致稀有鮈鲫生长停滞、肥满度系数降低,提示镉暴露后实验鱼能量存储减少,代谢发生紊乱。2)镉对稀有鮈鲫的毒性复杂,具有剂量和暴露时间的特异性;急、慢性镉暴露都可造成肝脏组织严重损伤,凋亡、自噬等调节细胞程序性死亡的生命过程紊乱;内质网的动态变化过程提示其在镉应激反应中具有重要功能。肝细胞功能减退,糖、脂代谢紊乱,伴随有炎症发生。一定浓度慢性镉暴露对稀有鮈鲫具有促进肝细胞增生和异变结构产生的作用。3)稀有鮈鲫Beclin1基因与其它脊椎动物相应基因具有高度同源性,该基因在稀有鮈鲫胚胎、胚后的整个生长发育阶段具有重要的作用,可能参与了水体镉暴露导致肝细胞自噬发生。另外,Beclin1可以作为以稀有鮈鲫幼鱼为对象的水环境镉暴露污染辅助生物指标。4)急性镉暴露后稀有鮈鲫脂代谢的紊乱与脂质的转运紊乱有关,并通过PLIN2、CAV2、PPARr、CPTII介导的代谢通路而调节脂滴形成。慢性镉暴露后稀有鮈鲫各器官的脂肪会被氧化分解,导致肥满度系数、内脏团重等显著降低,但肝脏组织T-CHO的含量升高,说明T-CHO的转运紊乱可能与慢性镉暴露脂滴沉积和脂代谢紊乱有关。5)急性镉暴露主要影响稀有鮈鲫H-P-I轴Cortisol的分泌和合成及其下游的GR的表达;并假设镉介导的Cortisol合成不是通过CRH-ACTH信号通路,而以MSH或其它激素介导的信号实现;然而通过FKBP5介导的GR下调和11β-HSD2的表达升高可以作为负反馈调节有利于缓解Cortisol紊乱带来的毒性。慢性镉暴露会影响H-P-I轴的所有激素的分泌,高浓度也会导致其基因表达和激素合成紊乱,并通过ACTH-MC2R的信号通路控制Cortisol的合成;FKBP5可能通过降低GR的活性而非表达而抑制Cortisol效应。6)稀有鮈鲫的肝脏转录组数据显示了肝脏具有调节消化吸收、免疫、生殖、蛋白合成等功能。镉暴露后,肝脏组织的离子平衡、氧化应激水平、脂肪的消化吸收等过程和功能可能受到干扰;慢性镉暴露对稀有鮈鲫生长的抑制可能与GH-IGF信号通路的抑制有关,而SCD-PEPC等的表达可能参与慢性镉暴露诱导的脂代谢紊乱。7)VtgAO1、SCD等基因可作为检测水体镉暴露的分子指标。