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缺血性脑血管病（ischemic cerebrovascular disease，ICD）作为一类有着较高致死、致残率的神经科常见疾病严重危害着人类的生命健康，给患者和社会造成了巨大的负担。目前临床上治疗该病的主要方法是药物治疗，但这些治疗并不能有效逆转已发生梗死的脑组织。因此，迫切需要寻找一种切实有效的修复受损脑组织的治疗方法以减轻脑缺血损伤，最大程度恢复神经功能缺损。传统观点认为中枢神经系统神经损伤后，由于内在的再生能力差和外在的微环境的抑制，坏死的神经组织不能自行恢复。成体神经干细胞的发现则打破了这一传统观点，给缺血性脑血管病的治疗带来了曙光。目前用于中枢神经移植的供体细胞主要有：胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）；神经干细胞（neural stem cells，NSCs）；骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）；脐血干细胞等。BMSCs是几年前才被确认的成体干细胞，因其具有取材方便、培养容易、多向分化潜能、易于接受外来基因、可取材于自身不涉及伦理道德问题等等优点，成为了医学领域乃至整个生命科学领域的研究热点。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor，GM-CSF）是一种常见的多功能造血细胞因子，它能动员骨髓、促进造血干细胞的增殖和分化、抑制白细胞的凋亡，从而提高外周血中白细胞的数目。最近，有多个学者报道GM-CSF具有神经保护作用，它能促进神经前体细胞分化、对抗神经细胞凋亡并促进神经系统功能的改善。本课题研究内容包括外源性GM-CSF诱导体外培养的BMSCs分化为神经细胞及其机制的研究、利用BMSCs为细胞载体转染GM-CSF基因的研究以及将GM-CSF基因转染的BMSCs移植治疗大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠模型的疗效观察，并对GM-CSF基因转染的BMSCs移植治疗缺血性脑血管病的作用机理进行了初步探索。本课题分成以下四个部分：第一章：体外培养的大鼠骨髓基质细胞可分泌粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子目的：研究体外培养的大鼠BMSCs可否分泌GM-CSF并观察BMSCs上GM-CSF受体（GM-CSF receptor，GM-CSFR）表达情况，为进一步探讨GM-CSF对BMSCs的诱导作用机制提供实验依据并为后一步的实验奠定基础。方法：培养和鉴定BMSCs；采用RT-PCR和ELISA方法，分别从mRNA和蛋白水平测定体外培养的BMSCs中GM-CSF的表达；并采用Western blot和RT-PCR方法检测第3、4、5、6代BMSCs上GM-CSFR的表达。结果：RT-PCR检测显示BMSCs中有较弱浓度的GM-CSF mRNA表达。在蛋白水平，采用ELISA法在培养的第一到第六代BMSCs的培养液和细胞蛋白中均可检测到低浓度的GM-CSF，其中第二代BMSCs的细胞蛋白中GM-CSF浓度明显高于其他代（P＜0.01），其余几代BMSCs的培养液和细胞蛋白中GM-CSF浓度无显著差别（P＞0.05）。Western blot和RT-PCR方法检测发现BMSCs上存在丰富的GM-CSFR表达，各代BMSCs之间GM-CSFR表达水平无显著差异（P＞0.05）。结论：体外培养的大鼠BMSCs可分泌少量的GM-CSF，并有丰富的GM-CSFR表达。第二章：外源性GM-CSF促进大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化为神经细胞目的：探索GM-CSF对BMSCs体外分化为神经细胞的诱导作用及其分子机制。方法：培养和鉴定SD大鼠BMSCs，取第五代BMSCs采用外源性GM-CSF进行分化诱导。分别于诱导后0h、6h、12h、24h、48h及96h行形态学观察，同时采用免疫细胞化学及RT-PCR等方法观察BMSCs体外是否表达神经细胞特异性抗原标志巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（neurone specific enolase，NSE）和胶质细胞原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）。为了进一步探讨BMSCs诱导分化的分子机制，我们在上述时间点采用Western blot方法检测BMSCs中p-CREB／CREB的表达。使用大鼠成纤维细胞作为阴性对照组。结果：与未诱导的BMSCs相比，外源性GM-CSF可诱导BMSCs体外横向分化为突触明确的神经细胞，出现神经细胞的形态特点，诱导后细胞表达神经细胞特异性抗原标志Nestin、NSE、GFAP。而阴性对照组的大鼠成纤维细胞形态在同样诱导条件下则无明显改变。Western blot发现给予GM-CSF诱导后6h，BMSCs中p-CREB水平开始增高，12h达到高峰，而CREB水平在诱导前后无显著性改变。结论：外源性GM-CSF可通过上调CREB磷酸化水平来诱导BMSCs向神经细胞分化。第三章：Lipofectamine介导的pUMVC1-mGM-CSF质粒转染大鼠骨髓基质细胞的实验研究目的：观察脂质体法将质粒转染体外培养的大鼠BMSCs的转染效率及外源基因的表达。方法：培养和鉴定BMSCs；采用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将pUMVC1-mGM-CSF质粒转染到体外培养的BMSCs；相同条件下将携带绿色荧光蛋白基因的gWizTMGFP质粒转染BMSCs；分别于转染后0h、6h、12h、24h、48h、96h及7d在荧光倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白基因的表达来计算基因转染效率，并按上述时间点应用RT-PCR和ELISA方法分别从mRNA和蛋白水平测定外源基因的表达。结果：荧光倒置显微镜观察发现转染后6h细胞开始表达绿色荧光蛋白，至48h表达绿色荧光蛋白的细胞数量最多，荧光强度最亮，基因转染效率可达40％。RT-PCR和ELISA检测结果显示转染后6h BMSCs开始出现mGM-CSF mRNA和蛋白表达，以后逐渐增强至48h最强，到转染后第7d还有较强的表达。结论：BMSCs易于接受外源基因并表达；阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导的质粒转染BMSCs是较好的质粒转染方法，该方法基因转染效率高，外源基因表达时间长。第四章：mGM-CSF基因转染的骨髓基质细胞治疗缺血性脑血管病目的：探讨GM-CSF基因修饰的BMSCs在大鼠脑梗死周边区域局部存活、分化及对神经功能的影响；明确同种异体BMSCs及GM-CSF基因转染的BMSCs移植治疗脑梗死的可行性及效果。方法：健康成年雄性SD大鼠135只随机分为假手术组30只和手术组105只，手术组又随机分为单纯注射培养基α-MEM组、BMSCs治疗组及GM-CSF基因修饰的BMSCs治疗组。均用线栓法制作短暂性MCAO模型。假手术组除不插线外其余步骤同MCAO模型。分离、鉴定SD大鼠BMSCs，取第三代BMSCs进行GM-CSF基因转染。于MCAO 24h后采用立体定位仪分别将α-MEM培养基、BMSCs和GM-CSF基因修饰的BMSCs植入到SD大鼠缺血脑组织周边区域，移植后第3天、7天和21天行神经功能评分，TTC染色法计算梗死体积，同时观察植入细胞在局部存活、分化情况，HE染色和TUNEL原位标记法定量观察缺血损伤周边区域凋亡神经细胞数目，免疫组化法观察缺血损伤周边区域微血管密度及海马区域原位干细胞的增殖。结果：异体大鼠BMSCs可在缺血脑组织周边区域定居、生存并分化为神经细胞。移植后第3天各组之间神经功能评分无显著性差异（P＞0.05）。移植后第7天和21天，与α-MEM组和BMSCs组相比，GM-CSF-BMSCs治疗组神经功能评分明显降低（分别P＜0.01，P＜0.05），梗死体积显著缩小（分别P＜0.01，P＜0.05），梗死周边区域凋亡细胞数目明显减少（分别P＜0.01，P＜0.05）而微血管密度明显增多（均P＜0.05），海马区原位干细胞的增殖显著增多（分别P＜0.001，P＜0.05）。结论：同种异体GM-CSF基因修饰BMSCs移植治疗脑梗死可行，明显优越于单纯BMSCs移植治疗。