肺癌是当前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,具有高转移、易耐药、易复发等特性,严重威胁着人类的健康和生存质量。由于肺癌早期具有隐匿性,约70%的患者在确诊时已进入晚期,肿瘤已发生转移,错过了手术的机会。化疗和放疗等传统疗法是治疗肺癌的主要手段,存在多药耐药现象和严重的毒副作用,治疗效果不佳。近些年来,肺癌的靶向治疗和免疫治疗虽取得了很大的进展,但5年生存率仅为17.4%。因此,开发具有疗效好、毒副作用小、不易产生耐药、多靶点的药物应用于肺癌及转移的治疗已经成为当前迫切需要解决的问题。由于肺癌的进展过程伴随着机体免疫紊乱,近些年来,中药复方能够全面地调整机体免疫状态,抑制肿瘤的生长和转移,延长生存期,显著提高患者的生存质量,在肺癌及肺癌转移的治疗中发挥越来越重要的作用。中药复方是中医中药的精华所在,具有多成分、多靶点、多途径治疗的独特优势。因此,中药复方抗肺癌生长和转移活性的研究已成为抗肺癌药物研究的热点之一。本课题所研究的益肺通络方（YFTL）是国家“十二五”科技重大专项研究（2013ZX10005004）中的自拟复方,具有益气养阴、化瘀通络、清热解毒等功效,临床上用于治疗多药耐药、广泛多药耐药肺结核。近几年研究表明YFTL可调节机体免疫功能,平衡Th1/Th2免疫应答,通过免疫调节、抗多药耐药和排毒等作用机制发挥抗结核作用。现代药理学研究表明YFTL中各药材及其主要活性成分均具有抗肿瘤生长和转移的活性,在抑制细胞增殖、诱导凋亡、抑制血管生成、减轻炎症反应、逆转多药耐药等方面均发挥重要的作用。另外YFTL的组方符合中医药治疗肺癌“扶正祛邪”的治则。因此,本课题首先研究了 YFTL体内抑制肺癌生长和转移的活性,并对其作用机制进行了初步探索。其次,为寻求更简化有效的中药复方,我们依据YFTL的配伍原则、抗肺癌转移的机制和中医药理论并参考现代药理学研究成果对含有11味药材的YFTL进行了改良,选用灵芝、丹参、百部、矮地茶四味药材组成益肺通络改良方（CMFE）,并从整体动物、细胞和分子水平对益肺通络改良方抑制肺癌生长和转移的活性进行了研究,并初步探讨了其可能的分子作用机制,为抗肺癌生长和转移的药物开发提供实验和理论依据。本课题的研究内容主要分为以下四部分:（1）益肺通络方对小鼠Lewis肺癌生长和转移的抑制作用及机制研究,（2）益肺通络改良方对人肺癌A549细胞生长和转移的抑制作用及机制研究,（3）益肺通络改良方对小鼠Lewis肺癌生长和转移的抑制作用及机制研究,（4）岩白菜素对环磷酰胺诱导的免疫抑制的保护作用研究。一、益肺通络方对小鼠Lewis肺癌生长和转移的抑制作用及机制研究我们首先建立了 Lewis肺腺癌小鼠模型,研究了 YFTL体内对肿瘤生长的抑制作用并考察了其对小鼠生存期和肝肾毒性的影响,同时采用免疫组化法和Western Blot法研究了 YFTL对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响;观察了 YFTL对Lewis肺癌小鼠肿瘤肺转移的疗效,并检测了 YFTL对肿瘤血管生成和转移相关蛋白表达的影响;采用ELISA法、流式细胞技术等从细胞因子、免疫细胞活性及免疫细胞比例等方面考察了 YFTL对Lewis肺癌小鼠免疫功能的影响;采用Western Blot法测定了相关信号通路中代表性蛋白的表达,研究了 YFTL对相关信号通路的影响,初步探讨了 YFTL的分子作用机制。（1）体内抑瘤研究结果表明,YFTL能够明显地抑制Lewis肺癌小鼠肿瘤生长,灌胃200和400 mg/kg的YFTL抑瘤率分别为48.4%和62.0%,而且在给药剂量下没有明显的毒性。YFTL显著延长了小鼠生存期,YFTL低、高剂量组小鼠的生命延长率分别为18.6%和34.1%。TUNEL结果表明YFTL可促进肿瘤细胞凋亡,Western Blot结果显示YFTL可能通过上调肿瘤组织中抑癌基因p53的表达,上调Bax和下调Bcl-2的表达从而诱导肿瘤细胞凋亡。（2）体内肿瘤转移研究结果表明,YFTL能够明显地抑制Lewis肺癌的肺转移,200和400 mg/kg的YFTL处理后小鼠肺转移灶发生率分别为90%和80%,对Lewis肺癌的肺转移抑制率分别为47.1%（p<0.01）和61.5%（p<0.001）。YFTL能够抑制肿瘤组织中的微血管密度（MVD）,下调肿瘤组织和肺组织中VEGF、MMP-2、MMP-9、Vimentin的表达,上调E-cadherin的表达,表明YFTL抑制肿瘤转移的作用可能与其抑制肿瘤血管生成、抑制上皮间质转化（EMT）有关。（3）体内免疫研究结果表明,YFTL能够调节肿瘤组织中细胞因子的表达,上调IL-2和IFN-γ的表达,下调抑制性细胞因子IL-10和TGF-β1的表达;YFTL还可促进脾脏中T淋巴细胞的增殖、提高NK细胞的杀伤活性、上调CD4+/CD8+的比值及NK细胞的比例、下调Treg细胞的比例。这说明YFTL能够减轻荷瘤小鼠的免疫抑制,增强机体的抗肿瘤免疫应答,从而抑制肿瘤的生长和转移。（4）信号通路机制研究结果表明,YFTL可能是通过调节MAPK通路、抑制PI3K/Akt通路诱导肿瘤细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤生长的作用;YFTL可能通过抑制ERK,PI3K/Akt和TGF-β1/Smad2通路,抑制血管生成、阻断EMT的发生、抑制MMP-2和MMP-9的表达,发挥其抗肿瘤转移的作用;此外,YFTL对肿瘤免疫抑制的拮抗作用,可能与其抑制PI3K/Akt和TGF-β1信号通路有关。由此表明YFTL抗肺癌生长和转移的作用与其对多个信号通路的调节作用有关,体现了中药复方多靶点的独特优势。二、益肺通络改良方对人肺癌A549细胞生长和转移的抑制作用及机制研究基于益肺通络改良方（CMFE）中多种活性成分在体外均表现出良好的抑制肿瘤生长和转移的效果,我们首先在体外利用人肺腺癌A549细胞对CMFE体外抑制肺癌生长和转移的活性进行了评价。采用MTT实验检测了 CMFE对细胞活力的影响;使用流式细胞术结合PI单染法和Annexin V/PI双染检测了 CMFE对细胞周期和细胞凋亡的影响;通过划痕实验、Transwell实验考察了 CMFE对细胞侵袭和转移的影响;利用Western Blot法检测了周期、凋亡、侵袭和转移相关蛋白的表达和相关信号通路中代表性蛋白的表达,初步探讨了 CMFE的分子作用机制。MTT实验结果表明CMFE可显著抑制肺癌细胞增殖,且具有时间和浓度依赖性。CMFE 作用 24h、48h、72h 的 IC50 值分别为 330.2±9.5 μg/mL、125.3±7.2 μg/mL、56.0±3.2 μg/mL。细胞周期和凋亡的检测结果显示CMFE将A549细胞阻滞于G2/M期,其中涉及到A549细胞中p53和p21的表达上调,Cyclin B1的表达下调;CMFE可诱导A549细胞凋亡,与其激活p53介导的Bax表达上调Bcl-2表达下调,促进cytochrome C释放,激活PARP和caspase 9密切相关。细胞迁移和侵袭实验结果表明,CMFE可显著抑制A549细胞的迁移和侵袭;Western Blot结果显示CMFE处理的A549细胞中E-cadherin的表达上调,Vimentin、MMP-2和MMP-9的表达显著下调,表明CMFE可能通过阻断细胞EMT过程、抑制细胞外基质降解,从而抑制细胞的侵袭和转移。此外,分子生物学机制研究结果显示,CMFE可能通过激活JNK和p38 MAPK通路,抑制ERK、PI3K/Akt和STAT3通路,实现抑制A549细胞增殖、诱导细胞G2/M期阻滞和凋亡、抑制细胞的侵袭和迁移,从而发挥抗肺癌生长和转移的作用。以上结果表明,在体外益肺通络改良方对肺癌细胞的生长和转移具有一定的潜在治疗作用。三、益肺通络改良方对小鼠Lewis肺癌生长和转移的抑制作用及机制研究体外实验确证了益肺通络改良方（CMFE）的抗肺癌生长和转移活性之后,我们建立了 Lewis肺癌小鼠模型,进一步对其体内抗肺癌活性进行了研究。考察了 CMFE对Lewis移植瘤生长的抑制作用并检测了 CMFE对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响,同时考察了 CMFE对小鼠生存期和肝肾毒性的影响;观察了 CMFE对Lewis肺癌小鼠肿瘤肺转移的疗效,同时采用免疫组化法和Western Blot法检测了 CMFE对肿瘤血管生成和转移相关蛋白表达的影响;采用ELISA法、流式细胞技术和免疫组化法等从细胞因子、免疫细胞活性和免疫细胞比例等方面考察了 CMFE对Lewis肺癌小鼠免疫功能的影响;采用Western Blot法测定了相关信号通路中代表性蛋白的表达,考察了 CMFE对相关信号通路的调节作用,探索了 CMFE的分子作用机制。（1）抑瘤研究结果表明,CMFE能够显著地降低肿瘤的重量,灌胃200、400 mg/kg的CMFE对Lewis肺癌小鼠的抑瘤率分别为51.2%、67.4%,抑瘤率与YFTL相当,且在给药剂量下具有较好的安全性。CMFE明显地延长了小鼠生存期,CMFE低、高剂量组小鼠的生命延长率分别为24.2%和40.7%。TUNEL结果表明CMFE可诱导肿瘤细胞凋亡,Western Blot结果显示CMFE通过上调肿瘤组织中p53的表达,促进其下游促凋亡因子Bax的表达,下调Bcl-2的表达,进而促进线粒体中cytochromec的释放,上调cleaved PARP,从而诱导肿瘤细胞凋亡,实现抑制肿瘤生长。（2）体内肿瘤转移研究结果表明,CMFE能够明显地抑制Lewis肺癌的肺转移,200和400 mg/kg的CMFE处理后小鼠肺转移灶发生率分别为80%和50%,对Lewis肺癌的肺转移抑制率分别为59.2%（p<0.01）和78.6%（p<0.001）,高剂量的CMFE对Lewis肺癌的肺转移抑制率较相同浓度的YFTL提高了 28%。CMFE可以抑制肿瘤组织中的CD34和VEGF蛋白的表达,下调血清中VEGF的水平,抑制肿瘤组织和肺组织中MMP-2、MMP-9的表达,增加E-cadherin的表达,从而抑制肿瘤血管生成、降低肿瘤细胞的侵袭和迁移,发挥抗肿瘤转移的作用。（3）对荷瘤小鼠免疫研究结果表明,CMFE可上调肿瘤组织中IL-2和IFN-γ的表达、下调肿瘤组织中抑制性因子如IL-10,TGF-β1和VEGF的表达、显著增加肿瘤组织中CD8+T细胞的浸润和CD86的表达,从而拮抗肿瘤微环境的免疫抑制,增强机体的肿瘤特异性免疫应答;此外,CMFE能够促进脾脏中T淋巴细胞的增殖、提高NK细胞的杀伤活性、上调CD4+T、CD4+/CD8+的比值及NK细胞的比例,下调Treg细胞的比例,减轻荷瘤小鼠的免疫抑制状态,提高机体免疫抗肿瘤作用。以上结果表明CMFE可激活机体免疫系统抑制肿瘤的生长和转移。（4）信号通路机制研究结果表明,CMFE可能通过调节MAPK、抑制PI3K/Akt和STAT3通路来诱导肿瘤细胞凋亡,发挥抗肿瘤生长的作用;CMFE抑制肿瘤的血管生成、侵袭和转移可能与其抑制ERK、PI3K/Akt/mTOR和STAT3通路有关;此外,CMFE拮抗肿瘤微环境的免疫抑制、增强机体的抗肿瘤免疫应答的作用可能与其抑制PI3K/Akt/mTOR和STAT3通路有关。由此表明CMFE抗肺癌生长和转移的作用机制与多个信号通路的调节作用有关,体现了中药复方多靶点的独特优势。四、岩白菜素对环磷酰胺诱导的免疫抑制的保护作用本部分采用环磷酰胺（CTX）诱导建立了免疫抑制小鼠模型,以益肺通络方及其改良方中研究较少的矮地茶的主要活性成分岩白菜素为研究对象,考察了其对CTX诱导的免疫抑制小鼠的保护作用,以填补该方面的缺失。与正常对照组相比,CTX造模后小鼠饮食明显减少、毛发粗糙、无光泽、体重减轻,岩白菜素给药后,小鼠的上述状况明显得到改善。氧化应激标志物的测定结果表明岩白菜素能够减轻CTX导致的抗氧化酶活性的降低、脂质过氧化物丙二醛（MDA）水平的升高,从而减轻CTX诱导的氧化应激。外周血中血细胞计数结果表明,岩白菜素可阻止CTX诱导的红细胞、白细胞、血小板的减少,尤其是白细胞,从而拮抗CTX对小鼠造血功能的抑制作用。从免疫器官、细胞因子、免疫细胞等不同水平考察岩白菜素的免疫调节活性,结果表明岩白菜素能够提高免疫器官指数、增加免疫球蛋白（IgG、IgM）水平、调节Th1/Th2细胞因子的平衡、增强免疫细胞（巨噬细胞,T、B淋巴细胞,NK细胞,CTL细胞）的活性、恢复CD4+/CD8+的比值,从而促进机体非特异性和特异性免疫功能的恢复。以上结果表明岩白菜素可以从免疫调节和抗氧化方面减轻CTX导致的副作用。综上所述,本课题首次将抗结核的中药益肺通络方（YFTL）用于肺癌的治疗,确证了其对肺癌生长、转移的抑制作用,并对其作用机制进行了研究;然后在YFTL的基础上对其进行了改良,将YFTL中11味中药简化为益肺通络改良方（CMFE）的4味中药,并从细胞、分子、整体动物水平对其体内外抗肺癌功效和作用机制进行了研究。结果表明益肺通络方及其改良方对肺癌的生长和转移均具有显著的抑制作用,同时延长了荷瘤小鼠的生存期,且在体内具有较好的安全性。这两个中药方剂能够调节肺癌生长和转移相关的多个信号通路,通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成、抑制肿瘤细胞的侵袭和转移、拮抗肿瘤微环境的免疫抑制、增强荷瘤小鼠的免疫功能等多种机制发挥抗肺癌生长和转移的疗效,为中药复方在肺癌治疗中的应用开发提供实验和理论依据。与YFTL相比,益肺通络改良方的抑瘤率与YFTL相似,而其抗肿瘤转移的活性得到明显提高,抗肿瘤转移效果比YFTL提高了 28%;此外,改良方简化了中药复方的组成、降低了中药材成本;综上表明益肺通络改良方是极具开发潜力的、低毒、多靶点的有效控制肺癌生长和转移的中药方剂。此外,对两个方剂中研究较少的矮地茶的主要活性成分岩白菜素逆转环磷酰胺诱导的免疫抑制作用进行了研究,为其与化疗药物的联用及治疗免疫抑制性疾病的应用提供了实验依据。