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目的:本研究采用高脂高糖高盐饮食(高复合饮食,HFSSD)给予亲代(F0)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠交配前暴露,且子一代(F1)雄鼠进一步给予高复合饮食二次暴露,观察雄鼠高复合饮食暴露对子二代(F2)肾功能的影响并探讨可能的机制。方法:1.动物模型建立与动物实验流程:将F0雄性SD大鼠随机分为两个组:(1)对照饮食组(CD,n=15),给予对照饮食喂养9周;(2)高脂高糖高盐饮食组(HFSSD,n=15),给予HFSSD喂养9周。之后两组与对照饮食喂养的雌鼠交配产生F1代。F1大鼠第一个阶段:雌鼠怀孕阶段至F1第15周,均采用对照饮食喂养,第二个阶段:F1第15周至第24周,分别从两组的F1中随机取2只雄鼠给予HFSSD喂养二次暴露9周,同时分别从两个组的F1中随机取2只雄鼠给予CD喂养。第24周上述8只F1雄鼠与12只对照饮食喂养的F1雌鼠交配产生F2代。F2分为4组:(1)F0CD+F1CD组:F0和F1雄鼠均喂养对照饮食的子二代,记为对照组;(2)F0CD+F1HD组:F0亲代雄鼠喂养对照饮食和F1雄鼠喂养高复合饮食的子二代;(3)F0HD+F1CD组:F0亲代雄鼠喂养高复合饮食和F1雄鼠喂养对照饮食的子二代;(4)F0HD+F1HD组:F0和F1雄鼠均喂养高复合饮食的子二代,记为高复合饮食两次暴露组。F2均采用常规饲料喂养。F2大鼠分别在0、2、3、6、9、12、15、18、22、25周测量体重,第15周时用代谢笼收集24小时尿液,第25周全部处死收集血液和肾脏组织。2.F2肾功能血清学指标和尿液指标检测:F2大鼠腹主动脉采血,分离血清,采用ELISA方法检测血清胱抑素C,采用全自动生化分析仪测定血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、尿酸。取F2大鼠代谢笼收集的24小时尿液,测量尿液容积,离心后取上清液,采用全自动生化分析仪检测尿微量蛋白含量、尿总蛋白和尿肌酐含量。3.F2肾脏体视学指标检测:F2大鼠肾脏组织石蜡包埋后制作肾皮质切片,采用PAS染色法检测肾小球数目,肾小球大小,并计算肾小球硬化指数。采用天狼星红染色检测肾间质纤维化。4.F2肾组织mRNA表达谱芯片分析:取雌鼠F0CD+F1CD组和F0HD+F1HD组肾脏组织各7例应用Affymetrix基因芯片技术进行mRNA表达谱分析,筛选具有差异性的mRNA。用GO分析对差异mRNA进行功能注释,预测差异表达的mRNA高富集的生物学过程、细胞组分和分子功能。用KEGG信号通路分析对差异性mRNA信号通路注释,预测差异表达的mRNA高富集的生物学信号通路。采用实时荧光定量PCR方法进一步验证四组F2肾脏组织中筛选的差异基因的mRNA表达水平。5.统计学方法:实验数据采用SPSS 22.0统计软件进行分析,以均数±标准差(Mean±SD)表示,两组间比较采用两独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,若方差齐则采用LSD法,若方差不齐,则采用多重比较Dunnett’s T3法检验。P<0.05表示差异显著有统计学意义。结果:1.F2体重及肾脏重量检测结果:与对照组(F0CD+F1CD)比较,高复合饮食两次暴露组(F0HD+F1HD)的F2雌鼠体重显著增加。F2雌鼠和雄鼠左肾和右肾重量以及与体重比值在四组间无显著差异。2.F2肾功能相关血清学指标检测结果:与F0CD+F1CD组相比,F0CD+F1HD组雌鼠的血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)含量显著降低,F0HD+F1CD组雌鼠的血清Cr、尿酸和胱抑素C的含量显著增加。F0CD+F1HD组雄鼠的血清尿酸含量显著增加。F0HD+F1HD组雌鼠和雄鼠胱抑素C的含量呈现增加趋势,但是无统计学差异。3.F2尿液指标检测结果:与F0CD+F1CD组比较,F0HD+F1HD组雌鼠尿微量白蛋白与尿肌酐比值显著升高,肾小球滤过率(glomerular filtration rate,GFR)与第25周体重比值明显降低。F0HD+F1HD组的F2雄鼠GFR与第25周体重比值显著降低,尿微量白蛋白与尿肌酐比率增加但不显著。4.F2肾脏体视学指标检测结果:与F0CD+F1CD组比较,F0HD+F1HD组的F2雌鼠和雄鼠肾小球数目和肾小球大小无明显差异,但是肾小球硬化指数显著升高,并且F0HD+F1HD组的F2雄鼠发生明显的肾间质纤维化。5.F2肾组织mRNA表达谱芯片检测结果发现:与F0CD+F1CD组比较,F0HD+F1HD组F2雌鼠肾脏内共有385种基因表达异常(FC≥1.5且P<0.05),其中218种基因(56.6%)表达上调,167种基因(43.4%)表达下调。GO分析显示差异表达的基因主要集中在MHC I类蛋白复合体、胞膜、高尔基体等细胞组分,影响抗原结合、受体结合等分子功能以及抗原加工与呈递和免疫应答等生物学过程。KEGG信号通路分析显示差异表达的基因主要富集在抗原加工与呈递、移植物抗宿主疾病、移植排斥反应、病毒性心肌炎、自身免疫甲状腺疾病和1型糖尿病等信号通路。筛选差异倍数较大的基因采用实时荧光定量PCR方法进一步验证。结果显示:在F2雌鼠中,与F0CD+F1CD组相比,F0HD+F1HD组大鼠肾脏组织中Enpp6和Tmem144基因mRNA表达水平显著降低,F0CD+F1HD组大鼠肾脏中Actr3b基因mRNA表达水平显著升高。在F2雄鼠中,与F0CD+F1CD组相比,F0HD+F1HD组大鼠肾脏中Ifi27和Acadsb基因mRNA表达水平显著升高,F0CD+F1HD组和F0HD+F1CD组大鼠肾脏中Cd300lf基因mRNA表达水平显著降低。结论:1.雄鼠交配前高复合饮食两次暴露导致F2体重增加和肾功能异常,且具有性别差异,以F2雌鼠肾功能异常更明显。2.雄鼠交配前高复合饮食两次暴露导致F2发生肾小球硬化、肾间质纤维化以及肾脏基因Enpp6、Tmem144、Actr3b、Cd300lf、Ifi27,Acadsb表达显著改变。3.肾小球硬化、肾间质纤维化和上述基因的表达异常可能是导致F2肾功能异常的重要机制。