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目的:程序性死亡配体1（Programmed death ligand 1,PD-L1）作为肿瘤细胞表达的免疫检查点,能与T细胞上程序性死亡受体1（Programmed death 1,PD-1）结合,引起T细胞耗竭和功能阻滞,进而抑制抗肿瘤免疫反应。以单克隆抗体为主要形式的PD-L1阻断疗法已在临床肿瘤治疗中展现出良好的疗效,但同时也面临着全身性免疫副反应,有限的应答效率和高昂的治疗成本等问题,亟需探索其他可替代的药物形式用于PD-L1阻断治疗。此外,受限于肿瘤的低免疫原性和免疫抑制性微环境,单一免疫治疗临床获益有限,而免疫治疗与其他治疗形式相结合的策略近年来受到广泛关注。因此,本论文以调控肿瘤PD-L1为目标,运用化疗免疫联合策略,设计了两种纳米递送系统对联合治疗药物进行共输送,以实现有效的协同抗肿瘤治疗。方法:1)合成并构建PEI-PLGA阳离子聚合物基因载体,通过纳米沉淀法制备共包载基因药物CRISPR/Cas9和化疗药物紫杉醇（PTX）的核心纳米颗粒。为增强纳米体系的稳定性及体内长循环特性,将PEG通过p H敏感的“linker”修饰至纳米粒表面,得到生物相容性良好的载药纳米体系(PCNPPTX+Cdk5)。随后,对PCNPPTX+Cdk5的物理化学性质、稳定性、生物安全性、p H响应特性、体外基因转染及PD-L1阻断效率等进行研究。建立小鼠B16F10黑色素瘤和CT26结肠癌模型,考察PCNPPTX+Cdk5的体内抗肿瘤能力,并通过流式细胞术、免疫荧光等对其潜在的抗肿瘤免疫机制进行分析。2)以PD-L1小分子抑制剂（BMS-202）和组蛋白去乙酰化酶抑制剂（西达本胺,CHI）为研究对象,探索PD-L1阻断疗法联合表观遗传调控的协同抗肿瘤效应。首先,在体外细胞水平考察CHI诱导肿瘤细胞凋亡的能力和机制,以及CHI和BMS-202对肿瘤免疫原性和PD-1/PD-L1的影响。随后,构建一种普朗尼克杂化脂质体共递送BMS-202和CHI。由于CHI较差的亲疏水性,常规脂质体制备方法的载药量有限,对此我们首先通过普朗尼克F127与CHI形成复合物（CHI-F127）来增强其水溶性。随后通过逆相蒸发法将BMS-202和CHI-F127包载于脂质体的不同区域,得到共包载BMS-202与CHI的载药脂质体（CHI/BMS-202@lip F）。此外,建立小鼠4T1原位乳腺癌模型和肺转移模型评价CHI/BMS-202@lip F的体内抗肿瘤和抗肿瘤转移能力,并对其潜在的抗肿瘤免疫机制进行研究。结果:1)体外纳米颗粒表征结果显示,PCNPPTX+Cdk5能有效负载PTX（包封率>90%）和CRISPR/Cas9（最低复合质量比为1:1）,水合粒径约100 nm,表面电势近中性,有良好的稳定性和生物安全性,同时也具有明显的p H依赖性的表面电荷转变和药物释放行为。细胞实验结果显示,纳米载体在B16F10黑色素瘤细胞系和CT26结肠癌细胞系的基因转染效率均在60%以上。负载CRISPR/Cas9-Cdk5质粒的纳米颗粒能显著地下调肿瘤细胞Cdk5和PD-L1的表达,并增加B16F10细胞对细胞毒性T细胞（CTLs）杀伤的敏感性。体内动物研究表明,纳米颗粒能有效聚集到肿瘤组织,明显改善PTX的体内药动学行为。在PD-L1高表达的B16F10黑色素瘤和低表达的CT26结肠癌,PCNPPTX+Cdk5都展现出良好的肿瘤抑制效果。通过对肿瘤组织进行免疫学机制分析可以发现,PCNPPTX+Cdk5能促进肿瘤组织中树突状细胞（DCs）的熟化和M2型肿瘤相关巨噬细胞向M1型的极化,并减少调节性T细胞（Tregs）的数量。此外,也显著提升肿瘤中CTLs的浸润以及抗肿瘤细胞因子（IFN-γ和颗粒酶B）的释放,从而明显改善肿瘤免疫抑制微环境和促进抗肿瘤免疫效应。2)基于表观遗传与肿瘤免疫抑制微环境的密切联系,我们探索PD-L1阻断疗法联合表观遗传调控的协同抗肿瘤效应。体外研究表明,BMS-202能阻断PD-L1重组蛋白对T细胞功能的抑制,恢复T细胞增殖和IFN-γ分泌功能。CHI能上调胞内ROS水平,诱导线粒体功能改变,进而激活线粒体凋亡途径诱导4T1细胞凋亡。进一步研究发现,CHI能促进4T1细胞内钙网蛋白向细胞膜上迁移,以及高迁移率族蛋白-1和ATP向细胞外的分泌。此外,当将CHI处理后的4T1细胞接种到小鼠皮下,能诱导小鼠产生“疫苗样”保护功能,抑制正常4T1细胞再接种后的肿瘤形成和生长。因此,通过细胞和动物水平证实了CHI能诱导肿瘤细胞产生免疫原性死亡,进而增强肿瘤细胞的免疫原性和后续的抗肿瘤免疫反应。载药脂质体（CHI/BMS-202@lip F）理化性质表征结果显示,CHI/BMS-202@lip F具有均一的粒径分布和良好的稳定性,CHI和BMS-202能高效地包载于脂质体的不同载药空间,其包封率分别为85%和95%。体内动物实验结果显示,脂质体能有效富集到肿瘤部位并保持长时间滞留。在小鼠4T1原位乳腺癌模型,CHI/BMS-202@lip F能有效抑制原位肿瘤生长和肿瘤转移,显著延长荷瘤小鼠生存期。在小鼠4T1肺转移模型,CHI/BMS-202@lip F能显著抑制循环肿瘤细胞在肺部的侵袭和沉积,明显降低肺肿瘤结节数,结节抑制率高达96%。通过对肿瘤组织的流式和免疫切片分析可以发现CHI/BMS-202@lip F处理后,肿瘤组织中DCs的熟化、NK细胞的浸润和活化以及T细胞的增殖浸润都有明显的增强,表明CHI/BMS-202@lip F能有效调节肿瘤的免疫微环境,促进抗肿瘤免疫效应。结论:综上所述,我们构建了两种药物递送系统实现对肿瘤PD-L1的表达或功能进行调节,并且明显改善肿瘤免疫抑制微环境,促进免疫“冷”肿瘤向“热”肿瘤转化,进而有效地抑制肿瘤的生长和转移。通过本文研究,希望为临床肿瘤免疫联合治疗提供可供参考的新策略和新思路。