当前,器官移植已经成为治疗多种脏器终末期疾病的唯一、有效方法。许多患者通过移植同种异体器官获得新生。然而,外来器官进入机体后不可避免地会激发受体的免疫系统,产生针对移植器官的免疫应答和排斥反应。已有多种新型免疫抑制剂应用于临床,虽然降低了移植排斥反应的发生率,但仍然存在两大类问题：第一,免疫抑制剂并不能完全抑制排斥反应的发生；第二,长期应用免疫抑制剂存在诸多不良反应,包括药物的毒性、过度抑制机体免疫力会造成感染和肿瘤新生等。因此,抑制同种移植排斥反应并诱导机体对供者抗原的特异性免疫耐受,使机体保持正常的免疫应答以抵抗微生物等病原体感染及肿瘤的发生,是解决器官移植排斥反应的最佳途径,也是移植领域攻关的热点。树突状细胞(dendritic cells, DC)是一类功能强大,并且是唯一能够激活初始T细胞的抗原提呈细胞,在识别和提呈抗原、启动免疫应答、诱导移植排斥反应中起着重要的作用。由于DC是一类异质性细胞群体,具有不同的亚群和不同的功能状态,不但在增强免疫反应上具有重要的作用,也具有抑制排斥反应、诱导特异性免疫耐受的潜力。有研究表明,未成熟DC缺乏共刺激分子CD80(B7-1)和CD86(B7-2)的表达,体外能够诱导同种抗原特异性的T细胞失能。体内未成熟DC存在着自然发育成熟的内在机制,而且器官移植术后受者体内产生的多种介质,如致炎性细胞因子、LPS等,均能促进DC分化成熟,使之拥有强大的免疫原性。因此,一些调控手段,如免疫抑制分子1,25-二羟维生素D共培养或白细胞介素10(interleukin 10, IL-10).转化生长因子β(transforming factor p, TGF-P)等修饰,可以使DC维持于稳定的未成熟状态,增强其耐受原性,是减轻移植排斥反应、诱导特异性免疫耐受的重要途径并具有潜在的临床应用价值。最具有代表性的共刺激分子是B7家族成员,最早发现的B7家族成员包括B7-1(CD80)和B7-2(CD86),可激活原始T细胞的CD28受体,刺激白细胞介素2(IL-2)的生成。随着研究的进展,B7家族的新成员逐渐被发现,B7-H1(又称为PD-L1)是B7家族的成员之一,被鉴定为PD-1 (programmed death-1,免疫抑制性受体程序性死亡蛋白)的配体。根据多个实验室的研究报道,PD-L1对T细胞反应的影响有共刺激和抑制两种作用情况,具体机理尚未完全阐明,目前尚有争议性。已有学者指出T细胞受刺激活化5-15分钟后,B7-H1和B7-DC先与其第二未明活化受体结合,上调T细胞表面CD40L的表达,促进T细胞的进一步活化；而24小时后,T细胞开始表达PD-1,PD-L/PD-1途径占主导作用,介导T细胞的凋亡并下调细胞因子的分泌,对T细胞的增殖产生抑制作用。PD-L1/PD-1共刺激途径可抑制T细胞受体介导的淋巴细胞增殖反应和细胞因子分泌,B7-H1缺陷鼠的表型亦表明B7-H1在体内有重要的负性调节作用。PD-L1/PD-1通路在移植免疫中起着重要作用。PD-L1/PD-1通路可抑制移植动脉病(graft arterial disease, GAD)O也有研究表明,PD-L1/PD-1通路提供给T细胞信号,影响着急性移植物抗宿主病(graft-vs-host disease, GVHD)的致死率。鉴于PD-L1对DC发育及免疫功能的重要调控作用,我们设想采用新型基因工程技术致敏未成熟DC,将会减缓或阻止DC的成熟过程,体内回输有利于减轻排斥反应,并可能诱导稳定、有效的供者特异性免疫耐受。本研究通过构建高表达mPD-L1-IgG1融合蛋白的酵母菌株,纯化制备mPD-L1-IgG1融合蛋白；体外培养、扩增并富集小鼠骨髓来源的DC,采用融合蛋白致敏未成熟DC,研究mPD-L1-IgG1致敏的未成熟DC的表型及功能的变化,以及体外诱导同种抗原特异性T细胞低反应性的作用和效果；通过建立小鼠同种异体异位心脏移植模型,观察mPD-L1-IgG1-DC体内减轻排斥反应、诱导心脏移植免疫耐受的效果,并探讨了可能的机制。第一部分酵母表达的PD-L1-IgG1融合蛋白表达、纯化和鉴定一、酵母表达mPD-L1/mIgG1Fc工程菌的构建目的：构建高表达mPD-L1/mIgG1Fc的酵母工程菌。方法：将mPD-L1基因与mIg基因依次定向克隆入酵母pPIC9k载体构建pPIC9k-mPD-L1-Ig融合基因表达质粒；以表达质粒电穿孔酵母感受态菌GS115,经MD板营养筛选、和G418+抗性筛选高拷贝酵母菌株。结果：成功构建了高表达PD-L1-IgG1融合蛋白的酵母菌株。结论：构建了mPD-L1/mIgG1Fc酵母表达的工程菌,为下一步蛋白纯化研究打下了良好基础。二、mPD-L1-mIgG1-Fc融合蛋白的表达与纯化研究目的：将成功构建了高表达PD-L1-IgG1融合蛋白的酵母菌株进行纯化、鉴定。方法：探索不同诱导时间和溶解氧含量对融合蛋白发酵表达产量的影响；探索和优化酵母上清中融合蛋白的各种纯化制备条件；建立新型融合蛋白的鉴定方法。结果：确定了酵母菌株的发酵条件是发酵72小时,甲醇诱导浓度是8ml/h,优化了融合蛋白的纯化方法,建立了mPD-L1-Ig融合蛋白的纯化流程,最终获得了纯度>95%的mPD-L1-IgG1融合蛋白,内毒素含量低于0.03pg/μg蛋白。结论：制备了符合生物学功能实验要求的mPD-L1-Ig融合蛋白,为进一步开展功能研究打下了良好基础。第二部分PD-L1-IgG1融合蛋白维持DC未成熟状态和低反应性目的：建立PD-L1-IgG1融合蛋白致敏DC方法,研究融合蛋白维持DC未成熟状态和诱导DC低反应性的能力。方法：用mPD-L1-IgGl融合蛋白致敏体外扩增的第5天的BALB/c小鼠骨髓来源的未成熟DC,流式细胞仪检测LPS刺激前后致敏DC的表型改变；将BALB/c来源的LPS-DC、imDC 和 mPD-L1-IgG1-DC,以不同比例与C57BL/6小鼠来源的T细胞进行混合淋巴细胞反应(MLR),并检测反应上清中细胞因子的含量；将BALB/c小鼠来源的imDC和mPD-L1-IgG1致敏DC分别经尾静脉注入C57BL/6小鼠体内(2×106细胞／只),7天取受者脾脏,检测受者脾脏T细胞与供者和无关第三者脾脏淋巴细胞的MLR情况。结果：致敏DC表面高表达mPD-L1-IgG1融合蛋白,致敏DC能有效抵抗LPS刺激而维持未成熟状态,其表面CD80、CD86及HLA-DR等分子的表达下调；MLR反应中致敏DC刺激同种异基因T细胞增殖的能力显著低于对照组,分泌Thl因子(IL-2、IFN-y)显著下降,Th2因子(IL-4、TGF-p)则明显上升；致敏DC免疫组脾脏T淋巴细胞接触供者抗原时,表现出明显的低反应性。结论：mPD-L1-IgG1能有效致敏未成熟DC,维持DC表型和功能保持未成熟状态,诱导DC低反应性。第三部分小鼠心脏移植急性排斥反应模型的建立目的：建立可用于移植急性排斥反应研究的小鼠心脏移植模型。方法：实验组的供、受体分别来自BALB/c、鼠和C57BL/6小鼠；对照组的供、受体来自BALB/c小鼠,每组各20对。采用Cuff血管吻合技术,在小鼠颈部进行异位心脏移植。心脏移植术后第7天,每组10只取移植心脏组织,用石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色,进行组织病理学分析。观察每组其余存活受体小鼠的移植心脏存活期。结果：手术成功率达92.5%(37/40)。移植后第7天病理组织检查结果显示：实验组排斥反应等级为3.55±0.44,对照组为0.40±0.32,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。实验组移植心脏存活(8.22±0.67)d,对照组移植心脏存活>100 d,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论：采用Cuff血管吻合技术,将BALB/c小鼠心脏移植至C57BL/6小鼠,可以建立稳定的小鼠心脏移植急性排斥反应模型。该方法手术成功率高,值得推广。第四部分PD-L1-IgGl-DC诱导小鼠心脏移植免疫耐受的作用和机制目的：建立PD-L1-IgG1-DC诱导小鼠心脏移植免疫耐受模型,探索其体内负向免疫作用机制。方法：选择C57BL/6小鼠为受体,在移植前7天,经尾静脉注入BALB/c、鼠来源的Day5-DC口PD-L1-IgG1-DC(2×106细胞／只),PBS组为对照,进行颈部异位心脏移植术,观察各组心脏移植物的存活期；术后第7天观察心脏移植物的病理改变,并测定体内血清细胞因子水平；分析受者脾脏T细胞对供者抗原的刺激反应和CTL效应。结果：PD-L1-IgG1-DC组心脏移植物平均存活天数为(24.2±3.29)d,比Day5-DC组和对照组均明显延长(P<0.01)；致敏DC组心脏移植物的病理改变明显轻于其它2组,血清中Thl细胞因子(IL-2、IFN-γ)水平较其它2组减低,而Th2细胞因子TGF-β水平升高、IL-4水平无明显差异；PD-L1-IgG1-DC组脾脏淋巴细胞对供者抗原的刺激反应下降明显(P<0.01),其在CTL反应中对靶细胞的杀伤活性明显弱于Day5-DC组和对照组(P<0.01)；PD-L1-IgG1-DC免疫组小鼠体内的CD4+CD25+Foxp3+Treg调节性T细胞显著升高。结论：PD-L1-IgG1-DC能够有效诱导小鼠心脏移植的免疫耐受,具有较强的免疫负向应答调控性能,其免疫负向调控功能主要由PD-L1诱生。全文总结rmPD-L1-IgG1融合蛋白可以有效致敏未成熟DC,制备mPD-L1-IgG1-DC,该新型DC在体外可抑制同种异基因T细胞的增殖,并抑制Thl细胞因子产生；BALB/c小鼠来源的mPD-L1-IgG1-DC经尾静脉注入C57BL/6小鼠体内,可诱导受者对供者的抗原特异性低反应性。应用小鼠同种异体心脏异位移植模型证实,移植前7d经尾静脉注射mPD-L1-IgG1-DC可以有效地延长心脏移植物的存活时间,明显地减轻移植心脏的病理改变。体内作用机制分析表明mPD-L1-IgG1-DC可以借助PD-L1的效应有效诱生调节性T细胞从而维持机体免疫耐受状态。本实验研究了mPD-L1-IgG1融合蛋白致敏的DC作为致耐原诱导移植免疫耐受的作用,为进一步探索用免疫负向因子调控DC亚群防治移植排斥反应提供了新的实验依据。