内皮抑素是一种血管生成抑制因子，能有效地阻断肿瘤血管的生长，具有很强的抗肿瘤特性，在治疗肿瘤及血管生成依赖性疾病方面具有广阔的应用前景。目前纯化内皮抑素的方法有凝胶层析、离子交换和亲和层析，这些方法纯化的内皮抑素虽然纯度较高，但成本昂贵，工艺繁琐，对环境不友好，不利于大量生产内皮抑素。而超滤技术操作方便，节约能耗，对环境友好，在生物分离中有其独特的适应性。 本论文针对目前存在的上述问题，选用组成型毕赤酵母表达和超滤技术对内皮抑素发酵条件及纯化进行以下三方面的研究，主要研究内容及结果如下： 1．毕赤酵母表达内皮抑素 选用整合内皮抑素基因的毕赤酵母工程菌进行活化培养，测定其生长曲线，确定出适合发酵表达的接种菌龄为24h，以此时间的活化菌种接种进行摇瓶发酵。通过单因素多水平试验对工程菌发酵的影响因子进行考察，研究接种量、发酵时间、摇瓶转速对菌体生长及内皮抑素表达的影响，确定出适宜内皮抑素表达的发酵条件为：5％接种量，发酵时间96h，摇瓶转速220rpm。在此发酵表达条件下测得毕赤酵母表达内皮抑素的表达量为34．23mg/L 2．超滤纯化内皮抑素 首先进行内皮抑素超滤纯化选膜试验。以上述发酵表达条件下的毕赤酵母发酵液为研究对象，根据内皮抑素的相对分子质量及超滤膜的特性选取PES-30(截留分子量为30kDa的聚砜膜)、PAN-50(截留分子量为50kDa的聚丙烯腈膜)、PAN-70的超滤膜(截留分子量为70kDa的聚丙烯腈膜)，在温度25℃，操作压力0．20MPa，pH=6的条件下进行超滤试验，滤液经SDS-PAGE检测结果显示：PES-30膜超滤后的发酵滤液中杂蛋白含量最少，内皮抑素百分含量达44．7％。 其次进行超滤操作条件的优化试验。采用选出的PES-30超滤膜对内皮抑素进行超滤纯化，通过考察发酵液随运行时间的变化，确定超滤运行时间为200s。选取影响超滤过程的主要因素，温度、操作压力、pH值进行研究，试验结果表明：随着压力的增大，发酵液通量增大，而膜阻减小；温度升高，发酵液通量增大，膜阻减小；pH值升高，发酵液通量下降，膜阻增大。采用L9(33)正交试验设计优化超滤操作条件，研究结果表明：压力、pH值和温度对内皮抑素超滤的影响程度为pH值>温度>压力，其中压力的影响在本试验选取的范围内不显著，最终确定最佳超滤操作条件为：pH=4，温度30℃，压力0．15MPa-0．25MPa。 3．超滤膜污染与清洗 通过超滤纯水实验，考察超滤过程中操作条件对纯水通量的影响。试验结果表明：超滤膜的纯水通量随着操作压力的升高而增大，随着温度的升高而增大，且超滤膜截留分子量越大的膜受操作条件的影响越大，而pH值变化对超滤膜纯水通量的影响不明显。 通过考察不同温度、pH值、压力对膜污染的影响发现：当操作压力增大时，超滤过程中的膜污染度增大；pH值升高时，超滤膜污染度增大；温度30℃时，超滤膜的污染度最小。利用海绵球、超声波和碱液三种方法对超滤膜进行清洗，比较三种方法清洗效果得出：超声波清洗和碱液清洗效果明显优于海绵球清水清洗，而且PES-30和PAN-50超滤膜用碱液清洗效果较好，P~-70则以超声波清洗效果更好。