论文ⅠPGIS亚硝基化修饰对体内硝酸酯类交叉耐受的影响及机制研究研究背景硝酸酯类药物作为最古老的心血管药物之一,由于其起效快,作用恒定等特点,仍被广泛应用于临床冠心病的治疗。临床上常用的硝酸酯类药物包括硝酸甘油(nitroglycerin,GTN)、硝酸异山梨酯、单硝酸异山梨酯等。硝酸酯类药物通过扩张外周血管,改善心肌血液分布,抑制血小板的聚集和黏附等作用,被应用于各种类型心绞痛的治疗。然而在频繁给药及连续应用的情况下,其抗缺血作用减弱甚至消失,即产生硝酸酯类药物耐受,从而成为其临床应用的一大阻碍。硝酸酯类耐受机制的研究主要有以下学说:血容量扩张学说,巯基耗竭学说,神经激素激活学说,线粒体功能障碍学说等。由此可见,硝酸酯类药物耐受的机制是复杂而尚不明确的,探索其中可能的机理是临床应用硝酸酯类药物中亟待解决的问题。硝酸酯类药物作为外源性一氧化氮(nitricoxide,NO)供体,在体内经过生物转换作用释放NO。NO通过经典的sGC/cGMP/PKG途径介导硝酸酯类药物的扩血管效应。作为体内重要的信号分子,NO除依赖经典的sGC/cGMP/PKG途径外,还可通过参与蛋白质的巯基亚硝基化过程调节细胞功能。蛋白质巯基亚硝基化修饰是NO与蛋白质半胱氨酸残基中的自由巯基(-SH)共价结合形成亚硝基硫醇(S-nitrosothiols,SNOs)的过程。研究表明,蛋白质亚硝基化修饰影响蛋白质的生物活性、稳定性、亚细胞定位以及蛋白质间相互作用,从而导致蛋白质结构和功能的改变,继而影响细胞的多种病理和生理过程。在花生四烯酸代谢通路中,前列腺素H2(Prostaglandin H2,PGH2)分别在前列环素合酶(Prostacyclin synthase,PGIS)和血栓素A2合酶的催化下形成前列环素(Prostacyclin,PGI2)和血栓素 A2(Thromboxane A2,TXA2)。TXA2 通过激活血栓烷素受体(TPr)引起血管收缩,而PGI2通过其特异受体诱导血管舒张,因此PGI2和TXA2共同调节血管舒张和收缩的平衡稳态。PGIS作为PGI2生物合成的限速酶,主要分布于血管内皮细胞和平滑肌细胞。PGIS活性下降或PGI2生成减少均可导致血管平滑肌细胞舒张反应减弱而收缩反应增强,使血管扩张效应降低。有研究报道,PGIS的功能缺失是导致硝酸酯类药物耐受的机制之一。研究表明,sGC亚硝基化是主动脉平滑肌细胞对NO脱敏的机制之一,证明蛋白质亚硝基化可能是硝酸酯类交叉耐受的重要原因。我们通过蛋白质氨基酸序列对比发现,不同物种PGIS蛋白在231位和441位氨基酸位点上均存在两个半胱氨酸,使得PGIS可能成为亚硝基化修饰的可能靶点。那么,PGIS是否可被NO巯基亚硝基化修饰?PGIS亚硝基化修饰对PGIS的功能产生怎样的影响?PGIS亚硝基化修饰是否为硝酸酯类药物交叉耐受的可能原因?基于以上分析,本研究拟从体外和体内水平探究各NO供体与PGIS的巯基亚硝基化反应,观察其对血管舒张功能的影响,并进一步探究PGIS发生亚硝基化修饰的半胱氨酸位点,为临床上硝酸酯类药物耐受的研究及预防提供相应实验依据。研究目的1.研究GTN是否诱导内皮细胞中PGIS亚硝基化修饰;2.研究PGIS亚硝基化修饰是否介导血管硝酸酯类耐受3.探究预防GTN耐受的方法。研究方法1.细胞刺激和转染(1)将 0.1 μM,1 μM,10 μM,50 μM,100 μM 浓度梯度的 GTN 与 HUVECs反应8小时,观察细胞中PGIS亚硝基化修饰水平和PGIS活性及PGI2、TXA2的生成;山东大学博士学位论文(2)预先用0.3 mM的NO清除剂Carboxy-PTIO或2.5 mM亚硝基化拮抗剂NAC处理细胞0.5小时,再向细胞加入10 μMGTN刺激8小时。观察各组细胞内PGIS亚硝基化水平和活性及PGI2、TXA2的生成;(3)合成野生型 PGIS(WT-PGIS)和突变型 PGIS(MT-PGIS-C231A、C441A、C231/441A)cDNA腺病毒并感染HUVECs。细胞转染腺病毒48小时后,加入10μMGTN反应8小时。观察细胞内PGIS亚硝基化水平及Cys231和Cys441突变对PGIS活性的影响。2.重组蛋白的体外实验构建及表达野生型和突变型PGIS(WT、C23IA、C441A、C231/441A)纯化蛋白。(1)将重组人PGIS蛋白与10μM的NO供体(GTN,GSNO,SNAP,SNP和SPNO)孵育两小时;(2)将野生型或突变型人PGIS蛋白与10 μM的GTN孵育两小时,检测各组PGIS蛋白亚硝基化修饰水平和PGIS蛋白活性。3.动物棋型建立(1)取40只8周龄SD雄鼠,随机分为以下4组:对照组,GTN组,NAC组,GTN+NAC组(每组10只)。预先给予NAC(50mg/kg/天)灌胃7天,7天后将含有GTN(100 mg/kg/天)的Alzet泵置入皮下间隙。3天后将大鼠处死;(2)选取60只8周龄ApoE-/-雄鼠并随机分为4组:WT-PGIS组,MT-PGIS组,WT-PGIS+GTN 组,MT-PGIS+GTN 组(每组 15 只)。尾静脉注射 WT-PGIS或MT-PGIS cDNA腺病毒,2周后,将含有GTN(100 mg/kg/天)的Alzet泵置入皮下间隙。3天后,将小鼠处死;(3)选取60只8周龄SD雄鼠并分为以下4组:空白对照组,GTN组,GTN+阿司匹林组,GTN+贝前列素组(每组15只)。阿司匹林(10mg/kg/天)或贝前列素(200μg/kg/天)灌胃两周,而后将含有GTN(100 mg/kg/天)的Alzet泵置入皮下间隙。3天后,将大鼠处死;(4)取40只8周龄SD雄鼠,取出主动脉并制备主动脉环,将主动脉环在生理盐水或1 mM的Tranylcypromine中孵育30分钟。通过离体血管环实验观察血管对GTN和SNP的张力变化。4.免疫沉淀反应(IP)提取细胞或组织蛋白,加入PGIS抗体与蛋白裂解液4℃旋转过夜。加入Protein A/G Agarose孵育4小时后离心取上清,经过Western blot检测细胞或组织中PGIS蛋白亚硝基化水平。5.蛋白免疫印迹分析(Western blot)细胞或组织蛋白经过凝胶电泳、转膜、一抗孵育、二抗结合、ECL等步骤观察PGIS蛋白表达及其亚硝基化修饰水平。6.组织免疫荧光染色(IF)免疫荧光染色检测主动脉血管中PGIS亚硝基化修饰水平。7.大鼠离体血管张力检测分离大鼠主动脉并制备5mm的环形血管环,通过离体血管环实验检测主动脉对硝酸酯类的舒张反应性。8.PGIS活性及PGI2,TXA2含量测定PGI2含量的测定由其稳定的代谢产物6-酮-PGF1α的测定替代。用ELISA试剂盒测定细胞或组织裂解液或血清中6-酮-PGF1α的水平。由于TXA2的不稳定性,通过测定其稳定的代谢产物TXB2代表TXA2的产生。取组织或细胞裂解液,使用ELISA试剂盒进行测量。研究结果1.GTN诱导PGIS巯基亚硝基化修饰体外实验中,NO供体(GTN,GSNO,SNAP,SNP,SPNO)均可与重组人PGIS蛋白发生巯基亚硝基化修饰;GTN使HUVECs中PGIS的巯基亚硝基化水平呈现浓度依懒性增加。体内实验中,Western blot及组织免疫荧光实验显示,GTN使主动脉组织中PGIS巯基亚硝基化水平显著升高。山东大学博士学位论文2.GTN抑制PGIS活性及PG12的合成体内实验与体外实验结果均显示:GTN使PGIS活性明显降低,使前列腺素代谢向PGI2方向转化减少,PGI2代谢产物6-酮-PGF1α生成减少。3.PTIO和NAG阻断GTN诱导的PGIS亚硝基化及对PG IS活性的抑制PTIO及NAC均可显著降低HUVECs和主动脉中由GTN所诱导的PGIS巯基亚硝基化水平。PTIO及NAC均可阻断GTN对PGIS活性的抑制,使6-酮-PGF1α和PGI2的生成增加,证明PGIS活性的降低可能为PGIS亚硝基化修饰所介导。4.蛋白质巯基亚硝基化导致GTN耐受体内实验中,NAC干预组的大鼠血管环恢复对GTN的舒张反应,抑制了GTN耐受,证明蛋白质的巯基亚硝基化是GTN耐药的重要影响因素。5.GTN诱导的PGIS巯基亚硝基化位于231及441号半胱氨酸位点体外实验中,分别突变Cys231或Cys441后PGIS亚硝基化反应减弱,而Cys231及Cys441均突变后PGIS亚硝基化水平明显减弱。体内试验中,尾静脉注射野生型及突变型PGIS cDNA腺病毒,结果显示突变C231/C441显著抑制了GTN对主动脉组织中PGIS的亚硝基化修饰。6.Cys231/Cys441突变抑制了 GTN诱导的PGIS活性下降及PG 12合成减少与GTN+WT-PGIS组中6-酮-PGF1α生成明显下降相比,GTN+MT-PGIS组中6-酮-PGF1α生成增加,且前列腺素代谢向PGI2方向转化增加,向TXA2方向转化减少。7.PGIS的231及441号半胱氨酸位点突变改善硝酸酯类交叉耐受离体血管环实验显示,Cys231/Cys441突变可明显改善血管环对于GTN、SNP和SNAP的舒张反应。8.阿司匹林和贝前列素对硝酸酯类交叉耐受的影响离体血管环实验显示,贝前列素和阿司匹林可明显改善主动脉环对GTN、SNP和SNAP的浓度依赖性舒张反应。9.Tranylcypromine 对 GTN 耐受的影响离体血管环实验显示,Tranylcypromine可使血管对GTN和SNP的浓度依赖性舒张反应显著减弱。结论1.GTN诱导PGIS的Cys231和Cys441位点亚硝基化修饰;2.GTN通过PGIS亚硝基化修饰使PGIS活性下降,PGI2生成减少;3.PGIS亚硝基化修饰介导体内硝酸酯类交叉耐受;4.应用阿司匹林和贝前列素可改善硝酸酯类交叉耐受。论文Ⅱ AMPKβ1亚硝基化修饰在高糖促进VSMCs钙化中的作用及机制研究研究背景糖尿病(diabetesmellitus,DM)是血管动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的重要危险因素之一。钙化作为糖尿病动脉粥样硬化(diabetic atherosclerosis,DA)最常见的并发症之一,一度被认为是不良心血管事件的独立预测因子,与斑块进展和不稳定性有密切关系。血管钙化是受血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)表型转换驱动的一个主动调节过程,VSMCs向成骨细胞表型转化以及VSMCs中骨矿物羟基磷灰石和基质囊泡的形成是血管钙化的核心事件。研究发现高糖可通过诱导成骨细胞结合因子和成骨细胞转录因子的表达,促进VSMCs转化为成骨样细胞,从而加速DA斑块内膜钙化的发生发展。尽管高糖促进VSMCs钙化的作用己被普遍认可,而其中的相关机制并不十分明确。腺苷酸活化的蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase,AMPK)是一种异源三聚体丝/苏氨酸蛋白激酶,由α(α1,α2)催化亚基与β(β1,β2)和γ(γ1,γ2,γ3)调节亚基组成,负责调节代谢和能量的平衡。β亚基C-端区域同源性较高,为连接α与γ亚基的桥梁。β亚基的CBM区域为糖原结合结构域,可能参与糖原对AMPK的调节作用。此外,β亚基还含有豆蔻酰化和磷酸化位点,参与调节AMPK活性和亚细胞定位。β1在肝脏中高表达,在骨骼肌中低表达;β2则相反。而在大部分细胞中主要以α1、β1、γ1异构体为主。本课题组前期实验显示,在高糖刺激下,VSMCs中AMPKβ1蛋白表达显著下降。多项研究表明,AMPK可负向调节斑块钙化进程,AMPK激活剂AICAR和二甲双胍均可抑制体外VSMCs钙化。那么AMPKβ1是否在高糖诱导的VSMCs钙化中发挥调节作用?而高糖刺激下AMPKβ1蛋白表达降低是通过什么机制导致?两者是否存在关联?这些问题尚未被研究者重视及探究。蛋白质巯基亚硝基化修饰是指游离的一氧化氮(nitricoxide,NO)与蛋白质内的半胱氨酸自由巯基共价结合形成亚硝基硫醇(S-nitrosothiols,SNOs)的过程。蛋白质亚硝基化修饰可影响蛋白质稳定性、活性、亚细胞定位和蛋白质间的相互作用,进而参与多种病理和生理过程。有研究表明,Western blot和PCR实验均证实在糖尿病模型大鼠中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)表达显著增加,NO产生增加。那么高糖诱导下AMPKβ1的降低是否由增加的NO与AMPKβ1的亚硝基化修饰导致?综上分析,本研究拟通过高糖和β-甘油磷酸诱导人主动脉平滑肌细胞(human aortic smooth muscle cells,HAMSCs)钙化,研究高糖诱导下AMPKβ 1蛋白表达降低的相关机制及AMPKβ1对高糖促进的VSMCs钙化的影响,为临床上预防和治疗血管钙化提供实验依据。研究目的1.研究高糖刺激是否诱导AMPKβ1亚硝基化修饰;2.构建并转染野生型及突变型AMPKβ1腺病毒,研究AMPKβ1亚硝基化修饰对高糖促进VSMCs钙化的影响及相关机制。研究方法1.细胞刺激与转染取6-8代HASMCs进行细胞实验,分别将5.5 mM及30 mM的葡萄糖溶液作为正常糖(NG)和高糖(HG)刺激。(1)将HG溶液分别按照0,6,12,24,48,72小时的时间梯度加入六孔板内,Western blot及RT-PCR分别检测AMPKβ1和iNOS的蛋白和mRNA表达水平;在10ng/ml白细胞介素-1β(IL-1β)孵育下,分别于0,6,12,24,48,72小时的时间梯度下加入HG,用一氧化氮检测试剂盒测定细胞内NO的生成;(2)分别将终浓度为0.2mM的Carboxy-PTIO,100 μM的 1400W或0.4μM的MG132预处理HASMCs2小时,而后加入高糖刺激。24小时后收集细胞,检测AMPKβ1的蛋白表达及亚硝基化水平;(3)研究高糖刺激对HASMCs钙化的影响。向培养基中加入10 mmol/的β-甘油磷酸(β-GP)以诱导细胞钙化。将实验分为以下四组:NG,NG+β-GP,HG,HG+β-GP,检测各组细胞的钙化水平;(4)将AMPKβ1过表达腺病毒转染HASMCs中,实验分四组:正常糖+空载体组(NG+Vector),正常糖+AMPKβ1过表达组(NG+AMPKβ1),高糖+空载体组(HG+Vector),高糖+AMPKβ1过表达组(HG+AMPKβ1),各组均加入10 mM β-GP诱导钙化,反应结束后收集细胞并检测各组细胞的钙化水平;(5)将野生型AMPKβ1 和突变型AMPKβ1(MT-AMPKβ1-C173A、MT-AMPKβ1-C223A及MT-AMPKβ1-C173/223A)转染HASMCs,转染成功后加入HG和10 mM β-GP诱导钙化,检测AMPKβ1亚硝基化水平及细胞钙化水平。(6)野生型AMPKβ1和突变型AMPKβ1(MT-AMPKβ1-C173/223A)转染HASMCs,24小时高糖刺激后检测细胞中AMPKβ1蛋白泛素化水平。2.生物素转化法(Biotin switch)用蛋白裂解液提取细胞蛋白,通过封闭游离巯基、Biotin标记、纯化Biotin标记蛋白等步骤获得纯化的亚硝基化蛋白,Western blot实验检测AMPKβ1的亚硝基化水平。3.免疫沉淀反应(IP)提取细胞蛋白,加入AMPKβ1抗体(1:50稀释度)与蛋白裂解液4度旋转过夜。加入Protein A/GAgorose并孵育4小时,离心取上清即得到AMPKβ1蛋白-抗体-珠子复合体。Western blot检测AMPKβ1的泛素化水平。4.蛋白免疫印迹检测(Western blot)提取HASMCs中的总蛋白,检测iNOS、AMPKβ1和Runx2的蛋白表达水平。5.实时荧光定量PCR(qRT-PGR)收集高糖刺激后的HASMCs并提取细胞内总RNA,检测AMPKβ1和iNOS的mRNA水平。6.茜素红染色4%的多聚甲醛固定细胞后,用茜素红染色液将六孔板内的细胞进行染色30分钟,PBS洗涤3次后置于显微镜下观察。7.钙含量测定用裂解液(PBS+1%TritonX-100)裂解细胞后,离心取上清并按照试剂盒说明测定细胞中的钙含量。8.碱性磷酸酶活性测定根据碱性磷酸酶试剂盒说明测定细胞中碱性磷酸酶活性。9.一扬化氮含量测定用一氧化氮检测试剂盒测定细胞中一氧化氮的含量。研究结果1.高糖刺激使HASMCs中AMPK β 1表达降低而i N0S表达增加HASMCs与HG溶液按时间梯度孵育,Western blot及qRT-PCR结果显示,随着时间递增,HASMCs中AMPKβ1蛋白表达逐渐下降,mRNA水平无显著变化;iNOS蛋白及mRNA水平均逐渐增加,细胞裂解液中NO含量逐渐增加。2.离糖诱导AMPK β 1中Cys173和Cys223位点亚硝基化修饰与放线菌酮刺激下的AMPKβ1降解速率相比,HG可明显增加HASMCs中AMPKβ1的降解速率,证明高糖诱导下AMPKβ1表达下降是由蛋白质降解增加所致。Biotinswitch实验显示,HG刺激下AMPKβ1的亚硝基化水平明显升高,并可被PTIO和1400W抑制。Cys173和(或)Cys223位点突变后,可明显减弱高糖诱导的AMPKβ1的亚硝基化水平。3.AMPKβ1亚硝基化通过泛素-蛋白酶体系统促使AMPK β1降解Cys173及Cys223的突变显著抑制高糖诱导的AMPKβ1泛素化水平的升高。MG132可逆转高糖刺激下AMPKβ1蛋白表达水平的下降。4.高糖促进HASMCs钙化与对照组相比,高糖刺激可明显提高HASMCs中Runx2表达,碱性磷酸酶(ALP)活性及钙含量。5.AMPKβ1与HASMCs钙化呈负相关AMPKβ1过表达可显著降低HASMCs中钙含量、Runx2的表达及ALP活性,证明AMPKβ1参与高糖刺激下HASMCs钙化进程且负向调节高糖刺激的HASMCs 钙化。6.AMPKβ 1亚硝基化对HASMCs钙化的影响与对照组相比,PTIO及NAC均可抑制高糖诱导的HASMCs钙化水平的升高。在HG刺激HASMCs的钙化中,与WT-AMPKβ1转染组相比,Cys173和(或)Cys223的突变可使细胞Runx2表达水平、钙含量测定和茜素红染色明显降低。7.亚硝基化通过降低AMPK β 1稳定性影响HASMCs钙化与对照组相比,MG132可明显下调HG诱导下HASMCs内Runx2蛋白表达。结论1.高糖通过促进iNOS/NO产生介导AMPKβ1中Cys173和Cys223位点发生疏基亚硝基化修饰;2.AMPKβ1亚硝基化通过泛素-蛋白酶体系统介导高糖刺激下AMPKβ1蛋白表达水平的下降;3.AMPK|β1亚硝基化促进高糖刺激下HASMCs的钙化。论文Ⅲ AMPKβ 1亚硝基化修饰对糖尿病动脉粥样硬化斑块钙化的影响及机制研究研究背景血管钙化(vascularcalcification,VC)是动脉粥样硬化和糖尿病血管病变的并发症,是不良心血管事件的独立预测因子。血管钙化是血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)在钙化调节因子的诱导下分化为成骨样细胞,并伴随磷酸钙羟基磷灰石晶体沉积在细胞外基质的过程。根据位置不同,血管钙化主要分为两种类型:动脉粥样硬化性内膜钙化和与糖尿病、慢性肾病等相关的中膜钙化。动脉粥样硬化钙化主要位于在血管内膜,随着病变进展可累及中膜。研究表明血管钙化的形成是一个涉及多因素、多系统控制的主动调节过程,包括炎症反应、氧化应激、细胞凋亡、脂质代谢紊乱、高血糖等。多项研究证实,高血糖是促进VC发生发展的重要因素之一,然而其中的具体机制尚不清楚。我们研究表明,AMPKβl亚硝基化修饰促进高糖诱导下HASMCs钙化,然而AMPKβ1亚硝基化修饰在体内水平对糖尿病动脉粥样硬化斑块钙化的影响及相关机制尚未被研究。本研究拟通过构建糖尿病动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠模型研究AMPKβ1亚硝基化修饰对斑块内膜钙化的影响,为临床上预防和治疗糖尿病动脉粥样硬化提供实验依据。研究目的1.研究AMPKβ1亚硝基化修饰促进高糖刺激下HASMCs钙化的机制;2.建立糖尿病动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠模型,通过转染野生型及突变型AMPKβ1腺病毒研究AMPKβ1亚硝基化对斑块内膜钙化的影响及其机制。研究方法1.细胞模型(1)将野生型AMPKβ1和突变型AMPKβ1 cDNA腺病毒转染HASMCs,加入高糖和10 mM β-甘油磷酸刺激,Western blot检测p-AKT及AKT蛋白表达;(2)HASMCs与10nmol/L胰岛素孵育2小时后,转染AMPKβ1过表达和对照病毒并加入高糖和10 mM β-甘油磷酸诱导钙化,Western blot检测p-AKT、AKT和Runx2蛋白表达。2.动物模型的建立(1)糖尿病小鼠模型的建立:将链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)按60mg/kg的量连续5天腹腔注射打入小鼠体内。血糖≥16.7mmol/L视为造模成功。(2)构建并转染 WT-AMPKβ1 和 MT-AMPK-C173/223A cDNA 腺病毒。建立2型糖尿病ApoE-/-小鼠模型并给与高脂喂养。2月后尾静脉注射WT-AMPKβ1或MT-AMPKβ1 cDNA腺病毒,继续饲养1个月后取材。3.体重及血液学指标的检测测量实验前后小鼠体重并用酶学法检测血清标本中血糖及血脂水平。4.组织学检测留取实验小鼠主动脉和心脏标本并制备成组织匀浆,一部分检测AMPKβ1亚硝基化水平和Runx2、p-AKT及AMPKβ1的蛋白表达,一部分检测主动脉中钙含量。制备主动脉根部冰冻切片,免疫组织化学染色方法检测斑块中Runx2和p-AKT的表达水平。5.生物素转化法(Biotin switch)提取主动脉组织蛋白,通过封闭游离巯基、biotin标记和纯化biotin标记蛋白等步骤获得纯化的亚硝基化蛋白,Western blot检测AMPKβ1的亚硝基化水平。6.蛋白免疫印迹检测(Western blot)提取细胞或主动脉组织中的总蛋白并检测AMPKβ1、Runx2和p-AKT的蛋白表达水平。7.钙含量测定用裂解液(PBS+1%TritonX-100)裂解主动脉组织,离心取上清后并按照试剂盒说明测定组织的钙含量。8.免疫组织化学染色将主动脉根部冰冻切片进行免疫组织化学染色以测定其中Runx2和p-AKT的表达水平。研究结果1.实验小鼠基本情况各组小鼠间体重及血脂水平无显著性差异。糖尿病组小鼠空腹血糖水平与对照组间有显著差异。2.AKT激活剂-胰岛素对AMPK β 1调节的HASMCs钙化的影响HASMCs钙化中,高糖刺激可显著提高AKT活性。与AMPKβ1过表达组中p-AKT和Runx2的低水平相比,胰岛素可显著提高AMPKβ1过表达HASMCs中p-AKT和Runx2的表达水平,证明AMPKβ1通过AKT/Runx2通路调节HASMCs 钙化。3.AMPK β 1亚硝基化修饰通过调节AKT活性影响HASMCs钙化Cys173和Cys223的突变可显著降低高糖诱导HASMCs钙化中AKT活性。4.AMPKβ 1亚硝基化修饰对糖尿病动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠斑块钙化的影响Western blot、组织切片免疫组化及主动脉钙含量检测显示,Cys173和Cys223突变可显著降低主动脉组织中p-AKT和Runx2蛋白表达及斑块中钙化水平。结论1.AMPKβ1亚硝基化修饰通过上调AKT/Runx2通路活性促进高糖诱导的HASMCs 钙化;2.糖尿病动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠中,AMPKβ1亚硝基化修饰通过上调AKT活性促使斑块内膜钙化水平升高。