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目的1.通过剂量-效应、时间-效应的分析,筛选出槐耳浸膏与化疗药物的最佳组合;2.探讨槐耳浸膏在胃癌MKN45细胞凋亡中的分子机制,并阐述其在PI3K/Akt信号通路中的作用机理。方法1.MTT法研究不同浓度的槐耳浸膏和化疗药物(5-氟尿嘧啶,顺铂,表阿霉素,紫杉醇)对MKN45细胞存活率的影响,倒置显微镜观察其形态的变化;2.将0.2mg/ml的槐耳浸膏分别与2.5ug/ml的5-氟尿嘧啶,0.5ug/ml顺铂,0.4u/ml的表柔比星和0.5ug/ml紫杉醇两两联合给药处理细胞,通过存活率的比较,筛选出最佳组合。3.RNAi(RNA interference,RNAi)技术转染目的基因Akt使其沉默;4.流式细胞术检测0.2mg/ml槐耳浸膏联合0.5ug/ml顺铂处理正常细胞的凋亡情况;5.RT-PCR检测0.2mg/ml槐耳浸膏联合0.5ug/ml顺铂处理正常细胞和转染细胞的P-Akt,T-Akt和P53 mRNA表达情况;6.Western Blotting法检测0.2mg/ml槐耳浸膏联合0.5ug/ml顺钼处理正常细胞和转染细胞的P53、caspase-9、T-Akt和p-Akt蛋白的表达情况。结果1.槐耳浸膏及化疗药物(5-氟尿嘧啶,顺铂,表阿霉素,紫杉醇)能降低MKN45细胞存活率,并呈时间和剂量依赖性;倒置显微镜下可见部分较小细胞核膜边缘出现多个突起后,细胞胞体缩小、核固缩、核碎裂,浓度越高,时间越长,细胞死亡越多。经不同化疗药物处理后细胞形态与经槐耳处理后表现大致相同。2.在24h和48h这两个时间点,通过分析发现5-氟尿嘧啶的抑制率增加了 17%和24%;顺铂为22%和26%;表柔比星为14%和23%;紫杉醇为15%和20%。我们选用0.2mg/ml的槐耳浸膏联合0.5ug/ml的顺铂两药联合,为本实验选用的最佳组合。3.相同倍数下,分别在倒置显微镜和荧光显微镜下观察,发现目的基因转染组出现微弱绿色荧光且细胞碎片增多。4.联合用药对正常细胞早期凋亡不明显,晚期凋亡率明显增加,且呈时间依赖性。5.无论对正常细胞还是转染细胞,槐耳浸膏联合顺铂联合给药上调人胃癌细胞MKN45,P53和Caspase-9的蛋白表达量,同时下调P-Akt和T-Akt mRNA的表达量。结论1.槐耳浸膏联合顺铂能够诱导MKN45细胞凋亡,且呈时间浓度依赖性。2.RNAi技术科特异性沉默目的基因Akt的表达,诱导细胞凋亡。3.槐耳浸膏联合顺铂在体外诱导胃癌细胞MKN45凋亡作用可能是通过抑制PI3K/Akt信号通路来实现的。