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穿心莲(Andrographis paniculata)是南亚和东南亚地区重要的传统药用植物,具有清热解毒、凉血、消肿等功效,用于邪毒内盛、感冒发热、咽喉肿痛、口舌生疮、顿咳劳嗽等。目前穿心莲除作为中药饮片外,还被制成多种现代剂型应用于临床。二萜苷类和黄酮苷类化合物为穿心莲主要有效成分,通常来源于化学合成或从原植物中提取分离,以上两种方式均难以满足商业化需求。与化学方法相比,酶法避免了使用大量有机溶剂对环境造成的污染,并减少副产物的生成,弥补了复杂结构化合物在合成过程中较难建立化学合成途径的缺陷。糖基化广泛存在于植物中,是一种重要的后修饰反应。糖基化可将糖苷配基转化为性质更稳定、结构和生物活性多样的糖苷。糖基转移酶是一类参与众多活性糖苷类化合物生物合成的关键酶,植物中存在大量的糖基转移酶执行不同的糖基化功能。对糖基转移酶这一多基因家族进行基因克隆和功能验证将具有重要意义,为酶法合成天然小分子化合物糖苷、开发糖基化工具酶以及新药研发提供了新的物质基础和基因资源。目前,国内外尚未见穿心莲糖基转移酶的研究报道。本研究在穿心莲(A.paniculata)中挖掘得到1条具有显著底物宽泛性及高催化效率的新颖二萜糖基转移酶及3条具有广泛底物谱并可对底物分子进行多位点糖基化的黄酮糖基转移酶,主要研究如下:1.穿心莲中糖基转移酶基因的挖掘以新穿心莲内酯为指标性成分,分析穿心莲植物叶片在茉莉酸甲酯诱导下的基因表达量,以确定候选的糖基转移酶。总共筛选得到9个糖基转移酶基因,其在茉莉酸甲酯诱导过程中新穿心莲内酯的积累模式与转录组中的表达模式一致,并对这9个基因进行了生物信息学分析。随后在原核表达体系中实现了候选糖基转移酶基因的外源表达。2.穿心莲中二萜糖基转移酶的催化功能研究通过对穿心莲中9个糖基转移酶基因的催化功能筛选,首次成功鉴定出1条对新穿心莲内酯苷元具有催化活性的糖基转移酶基因(ApUGT5),并采用液相色谱-质谱联用和核磁共振波谱对糖基化产物的结构进行了鉴定。ApUGT5为1条具有显著底物宽泛性及高催化效率的新颖二萜糖基转移酶,该酶可催化新穿心莲内酯苷元的C-19位羟基糖基化形成新穿心莲内酯,并能催化26种不同类型的底物,包括二萜及其衍生物、三萜、黄酮、生物碱、苯丙素、香豆素以及具有各种亲核性基团(-OH,-SH和-NH2)的简单芳香族类化合物。3.穿心莲中黄酮糖基转移酶的催化功能研究鉴定出3条对黄酮类化合物具有催化活性的糖基转移酶基因(ApUFGTs),利用液相色谱-质谱联用技术对糖基化产物的结构进行了鉴定。选择具有不同结构类型的化合物,包括黄酮类、黄酮醇、黄烷酮、异黄酮、二氢查尔酮、香豆素和其他具有-OH和-NH2基团的小分子芳香化合物作为底物进行酶促反应。对于同一底物,三个糖基转移酶催化得到的糖基化产物类型和转化率是不同的。对于一些黄酮类化合物底物,这三个糖基转移酶都表现出很强的位置选择性,均只产生一种糖基化产物,对于其他黄酮类化合物底物则可转化为不同的多位点糖基化产物。综上所述,本研究基于穿心莲叶片的转录组数据,对糖基转移酶同源基因进行筛选,首次成功鉴定出具有灵活的底物宽泛性及较高催化效率的一个二萜糖基转移酶(ApUGT5)和三个黄酮糖基转移酶(ApUFGTs)。这些糖基转移酶可以作为良好的工具酶用于不同结构类型的生物活性糖苷类化合物的合成,为二萜及黄酮类化合物糖基化机制的解析提供了分子基础,促进药物先导化合物结构多样性研究,为进一步运用酶工程以及用酶法或合成生物学对化合物进行修饰提供了依据。