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目的骨肉瘤是一种好发于儿童和青少年,恶性程度甚高的原发性骨肿瘤。该肿瘤易在早期出现远处肺转移,病死率较高,预后极差。探索骨肉瘤的具体发病机制以及新的诊治策略是改善其预后的重要途径。MicroRNAs(miRNAs)是一类真核生物内源性非编码微小RNA,与靶基因mRNA的3’非编码区(3’ UTR)的“种子序列”配对结合,从而降解靶基因mRNA或抑制其翻译。已有文献报道,miRNAs表达失调在骨肉瘤的发生、发展、侵袭和转移等过程中具有重要作用,本研究旨在探讨miR-208b在骨肉瘤组织和细胞系中的表达及其对骨肉瘤细胞系增殖、侵袭和转移能力的影响。方法首先利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法分别检测miR-208b在骨肉瘤组织、正常骨组织、人正常成骨细胞系NHOst和2种骨肉瘤细胞系(U20S和Saos-2)中的差异性表达情况,随后建立稳定表达miR-208b的骨肉瘤细胞系U2OS和Saos-2;分别通过CCK8实验和克隆形成实验检测骨肉瘤细胞的增殖能力;流式细胞术检测骨肉瘤细胞周期;裸鼠皮下成瘤实验在体内观察骨肉瘤细胞形成移植瘤生长能力;划痕愈合和Transwell侵袭实验检测骨肉瘤细胞运动迁移及侵袭能力的情况。进一步利用生物信息学分析预测miR-208b作用的靶基因,然后在骨肉瘤细胞系U2OS和Saos-2中通过荧光报告载体实验验证ROR2是否为miR-208b的直接靶基因;并利用qRT-PCR和蛋白印迹实验检测过表达miR-208b后,ROR2 mRNA和蛋白的表达水平变化。随后设计并合成ROR2-siRNA,并将ROR2-siRNA和siRNA control转染U2OS和Saos-2细胞,然后利用一系列功能实验检测沉默ROR2基因的表达对骨肉瘤细胞增殖、细胞周期、迁移及侵袭的影响。最后,恢复实验中在骨肉瘤细胞分别转染mimics control、miR-208b mimics、miR-208b mimics+pcDNA3.0 和 miR-208b mimics+pcDNA3.0/ROR2,利用一系列功能实验检测骨肉瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力的变化。结果:1.体内外过表达miR-208b均抑制骨肉瘤细胞生长活性和增殖能力:qRT-PCR实验数据表明,骨肉瘤组织标本中miR-208b的相对表达水平显著低于正常骨组织;且miR-208b在骨肉瘤细胞系U20S和Saos-2中的相对表达水平均明显低于人正常成骨细胞系NHOst,差异均有统计学意义(均P<0.05)。在骨肉瘤细胞系U20S和Saos-2中,与对照组相比,过表达miR-208b后细胞的生长活性和克隆形成率均明显降低(均P<0.05)。构建裸鼠皮下骨肉瘤种植瘤模型,过表达miR-208b的骨肉瘤Saos-2细胞在裸鼠皮下形成移植瘤的体积和重量均显著低于对照组。2.过表达miR-208抑制骨肉瘤细胞的细胞周期进程:流式细胞术检测结果显示在骨肉瘤细胞中,与mimics control组相比,转染miR-208b mimics的细胞GO/G1期所占比例明显增高,而S期所占比例明显降低。3.过表达miR-208b抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力:划痕愈合和Transwell侵袭实验结果表明,与mimics control组相比,转染miR-208b mimics的骨肉瘤U20S和Saos-2细胞的运动迁移率和侵袭能力均降低。4.miR-208b可以直接靶向结合ROR2 mRNA3’ UTR:利用生物信息学技术在PicTar和miRanda数据库中,发现miR-208b可以和ROR2 mRNA 3’ UTR的种子序列互补配对。通过荧光素酶报告载体实验检测可知,miR-208b能够识别构建到荧光素报告基因载体的ROR2 mRNA的3’ UTR,抑制荧光素酶的活性(P<0.05);而对于突变的ROR2 mRNA的3’ UTR则无显著差异性。5.miR-208b抑制ROR2的蛋白表达:与对照组相比,在骨肉瘤U20S细胞和Saos-2细胞中转染miR-208b mimics后,ROR2mRNA无明显变化,而其蛋白水平明显降低。6.沉默ROR2的表达抑制骨肉瘤细胞的增殖:在骨肉瘤U20S细胞和Saos-2细胞中,通过小RNA干扰技术使得ROR2蛋白表达水平明显降低。与对照组相比,ROR2-siRNA组骨肉瘤细胞的生长活性明显受到抑制,克隆形成率显著降低(均P<0.05)。7.沉默ROR2的表达抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力:划痕愈合和Transwell侵袭实验结果表明,与siRNA control组相比,转染ROR2-siRNA的骨肉瘤U20S细胞和Saos-2细胞的运动迁移率和侵袭能力均降低。8.miR-208b通过ROR2调控骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭过程:通过共转染 miR-208b mimics 和过表达 ROR2 的质粒 pcDNA3/ROR2,western blotting 检测证明在过表达miR-208b的基础上成功恢复ROR2的蛋白表达。与miR-208b mimics+pcDNA3.0 组相比,miR-208b mimics+pcDNA3.0/ROR2 组的骨肉瘤细胞的增殖活性明显升高,克隆形成率显著增高,细胞的运动迁移率明显增加,穿膜细胞数显著增多(均P<0.05),即miR-208b通过ROR2调控骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭过程。结论:1.MiR-208b在骨肉瘤细胞系U20S和Saos-2中明显低表达,过表达miR-208b可以显著抑制骨肉瘤细胞的生长活性、增殖能力、侵袭及迁移能力,并在裸鼠体内抑制骨肉瘤移植瘤的生长。2.生物信息学分析预测并利用荧光报告载体实验验证ROR2是miR-208b的直接靶基因,并在转录后水平上受miR-208b的负调控。3.单独沉默ROR2的表达后,骨肉瘤细胞的增殖、侵袭、迁移能力均明显受到抑制,这些实验结果与过表达miR-208b是一致的。4.在过表达miR-208b的基础上恢复ROR2的蛋白表达水平,骨肉瘤细胞的增殖、侵袭、迁移能力均明显恢复。综上所述,miR-208b通过负调控ROR2抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移及侵袭。