心肌缺血再灌注损伤是急性心肌梗死病人进行溶栓或经皮冠状动脉介入治疗(Percutanious coronary intervention,PCI)之后心肌损伤的重要原因,是血管再次开通引起的心肌继发损伤,目前尚无有效的缓解办法。虽然缺血后适应法被认为有一定的缓解作用,但操作复杂,可控性差,仍不能完全避免再灌注损伤。因此,研究探讨缓解心肌缺血再灌注损伤的有效方法有重要的临床应用意义。心肌缺血再灌注损伤涉及心肌细胞炎症反应、氧化应激、线粒体损伤、自噬、凋亡等方面,但其具体分子机制仍未研究清楚。microRNA作为一种广泛表达于所有组织和个体各个发展阶段,调节各种生理病理过程的功能性小分子,也参与了心血管疾病如心肌肥大,心衰、心肌梗死等的调节过程。凋亡是micro RNA的一个常见的调控过程。研究显示,促凋亡的p53蛋白在转录水平直接上调miR-34a的表达;抑制凋亡的Bcl-2的m RNA是miR-34a的靶分子。在肿瘤细胞中,p53能够通过增加miR-34a的表达而降低Bcl-2的表达,进而增加肿瘤细胞的凋亡,起到抗肿瘤的作用。然而,我们前期研究发现,大鼠心肌细胞株H9C2经氧糖剥夺再灌注(模拟缺血再灌注)损伤后,细胞中miR-34a水平明显增加。此时增加的miR-34a是否也与引起心肌缺血再灌注损伤的凋亡有关?未见报道。二甲双胍是国际用药指南推荐的安全性高、副反应较少治疗2型糖尿病的一线口服药物。除了通过抑制肝糖异生和葡萄糖释放起到降低血糖的作用外,还能够(1)通过调节micro RNA的表达对肿瘤起到抑制作用。例如,二甲双胍增加Let-7表达抑制乳腺癌,增加miR-26a抑制胰腺癌等;(2)对心血管有保护作用例如,二甲双胍可以降低所2型糖尿病患者全原因死亡率、心梗发生率;减少心梗患者和实验动物心肌梗死的面积与血清心肌酶水平;促进梗死后心肌的重塑。二甲双胍是否也对心肌的缺血再灌注损伤有保护作用?如有保护作用,其保护机制如何?是否与其促凋亡而抑制肿瘤的机制相反,是通过降低miR-34a抑制凋亡而实现的?未见报道。为了探讨上述问题,本文分别以实验动物,心肌细胞和临床标本为对象,进行以下三部分研究:(1)二甲双胍对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用;(2)二甲双胍对大鼠H9C2心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤的保护作用及其机制研究;(3)二甲双胍对急性心肌梗死后行经皮冠状动脉介入治疗的糖尿病患者心肌的保护作用。第一部分二甲双胍对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用目的:(1)探讨miR-34a在心肌缺血再灌注损伤中的作用;(2)二甲双胍是否对缺血再灌注损伤有保护?是否与miR-34a关联?方法:1通过结扎冠状动脉左前降支(Left anterior descending,LAD)再开通建立大鼠/小鼠心肌缺血再灌注损伤模型。2通过心肌TTC及Evans’蓝染色、心电图、苏木精-伊红(HE)染色血清心肌酶测定,观察心肌损伤。3通过心肌组织石蜡切片TUNEL染色检测细胞凋亡发生;RT-q PCR检测凋亡相关蛋白Bcl-2、p53的m RNA表达水平;western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、p53、caspase 3和cleaved caspase 3的蛋白表达水平。4进行相关性分析,证明本实验条件下心肌缺血再灌注损伤是否与凋亡的发生相关;心肌细胞的凋亡是否又与miR-34a的增加关联。5大鼠心肌缺血之后,于开通血管再灌注的同时颈静脉给予二甲双胍(3 mg/kg),用上述方法和指标,观察二甲双胍是否降低了心肌miR-34a的水平、减少了心肌细胞凋亡和心肌损伤。结果:1成功建立大鼠/小鼠心肌缺血再灌注损伤模型SD大鼠及C57BL/6J小鼠心肌缺血再灌注后,在LAD供血处心肌出现白色梗死区域;大鼠心电图的ST段抬高,血清心肌酶明显增加(P<0.05);大鼠LAD供血处心肌组织的肌纤维排列不规则,纹理模糊,出现多处纤维溶解、断裂,肌浆凝聚深染。结果表明,心肌缺血再灌注损伤模型建立。2心肌缺血再灌注损伤与心肌细胞凋亡增加有关TUNEL染色结果显示鼠心肌缺血再灌注损伤后,凋亡的心肌细胞比例增加了近十倍(P<0.01)。心肌细胞中抑制凋亡的Bcl-2及促凋亡的p53的m RNA及蛋白表达水平分别降低和增加(P<0.01);凋亡的执行蛋白Caspase 3的活化形式Cleaved caspase 3增加。结果说明,缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡增加。血清CK-MB水平与凋亡细胞的比例有较强的正相关(r=0.8657,P<0.01)。说明心肌损伤与心肌细胞的凋亡有关。3心肌缺血再灌注引起的细胞凋亡与miR-34a水平增加有关心肌缺血再灌注损伤后,不仅心肌的miRNA-34a水平升高(P<0.05),而且,增加的miR-34a的水平与其下游靶基因,抑制凋亡的Bcl-2的m RNA水平有一定的负相关(r=-0.499,P<0.01),与其上游的调控蛋白,促凋亡的p53的蛋白水平和凋亡的细胞比例(r=0.5024,P<0.01)有较强的正相关(r=0.7599,P<0.01)。结果说明,缺血再灌注损伤后,细胞可能通过增加p53的表达上调miR-34a表达,进而下调miR-34a的下游靶基因Bcl-2的表达,增加凋亡。4二甲双胍可减少心肌细胞凋亡,减少心肌缺血再灌注损伤二甲双胍可剂量依赖性地减少SD大鼠缺血再灌损伤的心肌梗死面积(P<0.05),减轻心肌纤维的不规则排列,降低血清心肌酶的活性(P<0.05),减少细胞凋亡的比例(P<0.01)。与此同时,二甲双胍也降低了miR-34a的表达,上调了抑制凋亡的Bcl-2、下调促凋亡的p53的m RNA与蛋白表达水平,减少cleaved caspase 3的蛋白水平,(P<0.05)。结果表明,二甲双胍可通过降低细胞的凋亡而保护缺血再灌心肌,这一保护作用可能与下调miR-34a有关。小结:1心肌缺血再灌注后,伴随miR-34a的增加,心肌细胞的凋亡增加,导致了心肌功能损伤;2二甲双胍可下调miR-34a,减少心肌细胞的凋亡而改善心肌缺血再灌注损伤。第二部分二甲双胍抵抗大鼠H9C2心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤的作用及其机制目的:证明二甲双胍通过下调miR-34a而减轻心肌细胞凋亡,并探讨其机制方法:1通过氧糖剥夺再灌注的方法,使H9C2心肌细胞受到类似整体的缺血再灌注损伤(氧糖剥夺6 h、再灌注2 h)。2用TUNEL染色和流式细胞仪检测心肌细胞发生凋亡的比例;用RT-q PCR检测细胞内miR-34a、Bcl-2的m RNA表达水平;用Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、caspase3及其活化形式cleaved caspase 3的蛋白水平。3将miR-34a mimic与inhibitor分别转染入H9C2细胞内过表达或敲低miR-34a后,观察不同转染时间或不同转染浓度条件下上述指标的改变。4氧糖剥夺后再灌注的同时,给予二甲双胍处理,用MTS法确定二甲双胍的浓度,观察二甲双胍对细胞内pre-miR-34a、miRNA34a、p53 m RNA的表达水平,caspase 3及其活化形式、Bcl-2、p53和SIRT1的蛋白表达水平,以及SIRT1去乙酰化酶活性变化的影响。结果:1氧糖剥夺再灌注使H9C2大鼠心肌细胞受到类似心肌缺血再灌注损伤:a.H9C2凋亡细胞比例明显增加(P<0.001);b.伴随miR-34a水平增加,凋亡相关的Bcl-2 m RNA和蛋白水平下降,Cleaved Caspase 3的蛋白水平增加(P<0.01)。结果表明,氧糖剥夺再灌注在H9C2细胞中模拟了心肌缺血再灌注的损伤。2氧糖剥夺再灌注(OGD/R)引起的细胞凋亡与miR-34a水平的增加有关TUNEL染色显示,分别用mimic和inhibitor过表达或敲低miR-34a后,H9C2细胞的凋亡数,Bcl-2的m RNA及蛋白水平能够随之剂量和时间依赖性的增加或减少(P<0.001),凋亡相关蛋白Cleaved Caspase 3水平降低或增加(P<0.01)。说明miR-34a水平的增加确实可导致H9C2细胞的凋亡,与氧糖剥夺再灌注下心肌细胞凋亡有关。3二甲双胍对H9C2发生氧糖剥夺再灌注损伤有抵抗作用。二甲双胍使OGD/R细胞的凋亡比例较减少;敲低miR-34a时可以达到类似二甲双胍的治疗效果,如果同时给予二甲双胍则可使凋亡相关蛋白表达下降的更明显。3二甲双胍降低p53的表达和乙酰化水平,下调miR-34a的表达在氧糖剥夺再灌注条件下,二甲双胍虽对低表达的去乙酰化酶SIRT1蛋白水平没影响,但使心肌细胞下降的SIRT1活性明显上升,Ac-p53(Acetyl K381)的水平降低,p53的表达水平下降,以及pre-miR-34a的表达水平下调。小结:1在氧糖剥夺再灌注条件下,miR-34a表达上调是H9C2心肌细胞发生凋亡的原因之一。2二甲双胍不仅下调了p53的表达,还通过上调去乙酰化酶SIRT1的活性减少了转录活性的Ac-p53量,进而下调了miR-34a的表达。第三部分二甲双胍对糖尿病患者急性心肌梗死后行经皮冠状动脉介入损伤的抵抗作用目的:探讨患者心肌缺血再灌注损伤与血清miR-34a的关系以及二甲双的影响方法:1随机选取急性ST段抬高的心肌梗死后行PCI的病人90例,检测PCI术前术后静脉血中心肌酶CKMB活性,以及miRNA34a水平,行术前和术后90 min标准12导联心电图检测,人工测量所有导联的ST段相对于基线的抬高值,将各导联抬高值相加后即为ST段升高值总和。2选出术前心梗位置(V1-V6导联ST段抬高)和程度(V1-V6导联ST段抬高值总和)相同的患者,分成四组:(1)在发病前只服用二甲双胍的患者、(2)只服用他汀类药物的患者、(3)同时服用二甲双胍与他汀类药物的患者、(4)这两种药物均不服用的患者。分析miRNA34a水平,与相应ST段升高值总和及CKMB水平的相关性。结果:1 PCI术后患者ST段升高总值下降。表明,术后心功能改善2 PCI术后患者CKMB活性升高。表明,术后有心肌缺血再灌注损伤3 PCI术后患者血清miR-34a升高,并与CKMB活性正相关(r=0.4557,P<0.01),与术前与术后ST段升高值总和之差负相关(r=-3404,P<0.001)。表明,miR-34a与心肌缺血再灌注损伤相关4服用二甲双胍组患者的miR-34a水平除了与同时服用二甲双胍和他汀药物的患者无区别(P=0.3965>0.05)外,均低于单服用他汀类药物(P<0.001),服用其他糖尿病治疗药物(P<0.05),以及服用其他非糖尿病治疗药物(P<0.05)三组的患者。表明,二甲双胍可降低心肌缺血再灌注导致的miR-34a水平增加。小结:心肌梗死患者行PCI术前术后体内血清miR-34a水平与心肌损伤相关。二甲双胍通过影响miR-34a表达水平对心肌缺血再灌注损伤有保护作用。结论:1心肌缺血再灌注后会发生心肌损伤,此过程与心肌细胞凋亡增加相关,而凋亡增加是与miR-34a相关的。二甲双胍可通过下调p53蛋白表达进而降低miRNA34a的表达,使其下游靶基因Bcl-2的m RNA及蛋白表达水平降低,最终引起凋亡蛋白Caspase 3及其活化形式减少,表现为心肌细胞凋亡发生减少。2二甲双胍通过上调去乙酰化酶SIRT1的活性,减少p53在m RNA和蛋白上的表达水平;而p53作为miR-34a的上游调控蛋白,当它的表达下调时,miR-34a的表达也就相应下调,进而减少了缺血再灌注损伤引起的细胞凋亡。3心肌梗死患者行PCI术前术后体内血清miR-34a水平与心肌损伤相关。二甲双胍通过影响miR-34a表达水平对心肌缺血再灌注损伤有保护作用。