研究背景:　　 呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)是引起婴幼儿呼吸道感染最重要的病原体，不仅可在急性期引起毛细支气管炎或肺炎，还与哮喘密切相关。目前有关RSV感染引起急性喘息及持续性哮喘的发病机制尚未完全明确，胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic Stromal Lymphopoietin,TSLP)是近年发现的新型细胞因子，作为病毒感染与哮喘间的桥梁而倍受国内外关注，TSLP来源于胸腺基质细胞和上皮细胞，特别是经抗原激活的支气管上皮细胞。TSLP通过OX40L受体来刺激炎症性树突细胞的生成，进而刺激幼稚CD4+T淋巴细胞增殖，在气道周围创造一个辅助T细胞(helper T lymphocyte，Th)2优势分化的微环境，分泌Th2型细胞因子，促发Th2炎症反应，导致哮喘的发生发展。关于毛细支气管炎患儿体内TSLP水平如何变化，以及RSV感染气道上皮细胞后是否通过上调TSLP合成而促进趋化因子分泌，增加嗜酸性粒细胞与中性粒细胞气道浸润，从而启动气道高反应性和继发哮喘，目前国内外尚未见研究报道。迄今为止，尚无安全有效的抗RSV疫苗及治疗药物问世。痰热清注射液作为复方中草药注射剂，临床应用表明对呼吸道感染治疗效果肯定，但目前尚未见痰热清详细抗病毒机理探讨的研究报道。　　 研究目的:　　 1.系统观察RSV不同TCID50和不同感染时间作用人支气管上皮细胞(NormalHuman Bronchial Epithelium,NHBE)的细胞病变效应(Cytopathic effect，CPE)，探讨RSV感染NHBE的最佳条件，以成功建立RSV感染NHBE的体外模型，为进一步系统探讨RSV感染分子生物学机制提供有效的体外研究手段。　　 2.观察RSV感染对人支气管上皮细胞合成TSLP水平的影响，探讨TSLP在RSV性毛细支气管炎性急性喘息发病机制中的作用。　　 3.将痰热清以不同给药方式、不同给药时间干预RSV感染人支气管上皮细胞，观察其对TSLP合成水平的影响，探讨痰热清对TSLP有无抑制作用。　　 研究方法:　　 1.细胞培养和呼吸道合胞病毒扩增、定量：培养实验所需的人喉癌上皮细胞株(Hep-2)、人支气管上皮细胞(NHBE)。以RSV易感的Hep-2细胞进行病毒的繁殖、传代、冻存，以TCID50方法测定病毒滴度。　　 2.RSV感染NHBE体外模型的建立：将NHBE细胞接种于6孔细胞培养板中，取病毒悬液按每孔100 TCID50接种，动态观察接种24h、48h、72h、96h、120h后NHBE细胞形态学改变。并以实时荧光定量聚合酶链反应(Polymerasechain reaction，PCR)技术检测NHBE细胞中RSV核酸基因表达情况，鉴定RSV是否感染成功。　　 3.RSV对NHBE合成TSLP的影响：实验分NHBE组(正常细胞对照组)和RSV感染组，感染组加入不同滴度的病毒，分别以TCID501000、500、100、50、10接种于6孔板中已长至85％的NHBE。感染24h、48h、72h、96h、120h收集上清液，应用竞争性酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay，ELISA)检测上清液TSLP水平。　　 4.痰热清对RSV感染NHBE合成TSLP的影响：　　 (1)药物毒性测定：将NHBE接种于96孔板，加入10个稀释度的药物，每日记录细胞病变结果，确定药物的无毒性稀释度。　　 (2)痰热清对RSV感染NHBE后合成TSLP的影响：实验分3组：①预防方式给药组，病毒感染细胞前24 h给药；②直接灭活病毒组，感染时给药；③治疗方式给药组，病毒感染细胞lh后给药。感染12h、24、48、72h收集细胞上清，应用ELISA检测上清液TSLP水平。　　 5.统计学方法：符合正态分布连续性计量资料用均数±标准差(X±s)表示，多组均数比较采用方差分析；非正态分布计量资料用全距(中位数)表示，两组均数比较采用秩和检验；P＜0.01有统计学差异。所有数据统计均使用SPSS11.5软件包进行分析。　　 结果:　　 1.RSV感染NHBE体外模型的建立：RSV接种于支气管上皮细胞NHBE后，光学显微镜下观察见细胞胞体增大，透亮度降低，小部分细胞呈坏死聚集状。应用荧光定量PCR技术能从NHBE提取的总RNA中扩增出RSV病毒核酸的基因片段，证实RSV成功感染NHBE。根据系统观察CPE，确定感染时间为72小时和TCID50为100是RSV感染NHBE的最佳条件。　　 2.RSV对NHBE合成TSLP的影响：NHBE-RSV(1000)组(530.69±1.18)接种后120h TSLP分泌水平最高，显著高于接种后24h(150.73±1.55)、48h(140.33±2.12)、72h(347.99±1.53)和96h(440.95±1.23)(P均＜0.05)，并显著高于NHBE-RSV(500)组(360.49±0.27)、NHBE-RSV(100)组(321.84±1.35)、NHBE-RSV(50)组(261.38±2.22)、NHBE-RSV(10)组(114.92±1.63)、NHBE组(145.28±2.05)(P均＜0.05)。相同感染时间内，随着RSV感染滴度的增加，各感染组TSLP分泌水平均呈上升趋势，且与NHBE(正常细胞对照)组比较均有统计学差异(P均＜0.05)。相同感染滴度内，随着RSV感染时间的增加，各感染组TSLP分泌水平均呈上升趋势，且与NHBE(正常细胞对照)组比较均有统计学差异(P均＜0.05)。　　 3.痰热清对RSV感染NHBE合成TSLP的影响：经药物毒性测定，痰热清、利巴韦林无毒性稀释度分别为1:320、1:160。在4个不同给药作用时间内，痰热清、利巴韦林不同的给药方式组(预防给药组、直接灭活组、治疗给药组)与病毒对照组比较，均能显著降低RSV感染NHBE合成TSLP水平(P＜0.05)，并以预防给药方式下调TSLP的作用最为明显。预防给药方式下，痰热清组较利巴韦林组下调TSLP的作用更明显(P＜0.05)。　　 结论:　　 1.RSV感染喉癌上皮细胞株(Hep-2)，Hep-2可出现典型的融合病变。RSV成功感染人支气管上皮细胞株(NHBE)，NHBE仅出现细胞胞体增大，透亮度降低，坏死细胞增多成聚集状，不形成典型的融合病变。感染滴度TCID50为100和感染时间为72h是RSV感染NHBE的最佳条件。　　 2.RSV感染人支气管上皮细胞可显著上调TSLP合成水平。TSLP水平在感染后48h～72h开始上升，96h～120h达高峰，并随着RSV感染滴度的增加和感染时间的延长而升高，提示RSV感染诱导支气管上皮细胞TSLP合成水平增高可能是RSV引起急性喘息的主要分子生物学机制之一。　　 3、痰热清可显著下调RSV感染诱导支气管上皮细胞TSLP合成水平，其中以预防给药方式下调显著，提示痰热清对RSV感染TSLP合成有明确的抑制作用，可能为其抗病毒的机制之一。