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胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)的病原菌,引起猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病,给世界养猪业造成严重的经济损失。APP是猪呼吸道的专性寄生菌,通过空气和直接接触来传播。由于APP血清型众多,各血清型之间交叉保护力较低,传统的灭活疫苗和亚单位疫苗的效果均不理想。因此,迫切需要更安全、高效的新型疫苗来预防和控制该传染病的发生与流行。毒力因子的全面鉴定是病原菌致病机理研究和防治产品开发的基础。信号标签诱变(signature-tagged mutagenesis,STM)是一种经过优化的经典的转座子突变技术,可以用含多个序列标签的转座子构建病原菌的突变体库,通过宿主或实验动物来负向筛选致弱突变体,进而鉴定相关基因。自1995年首次建立以来,STM技术被广泛用于多种病原菌毒力相关基因的发掘与鉴定。很多病原菌为了适应体内外的环境会形成生物被膜(biofilm)。大量的研究表明,生物被膜的形成与病原菌的免疫逃避和抗药性有关,是影响感染的重要因素。本研究构建了APP血清1型的STM突变体库,从中筛选到2个生物被膜形成突变菌株,对突变基因进行了定位和克隆,对突变菌株的生物学特性进行了研究,为阐明APP生物被膜的形成机制提供了一定的试验数据。1.APP血清1型STM突变体库的构建以APP血清1型萘啶酸抗性菌株4074-N为受体菌,以携带mini-Tn10的标签质粒(pLOF/TAG1-48)的E.coli CC118λpir或Sm17-1λpir为供体菌,在或不在E.coli DH5α(pRK2073)的辅助下,进行三亲本或两亲本接合,通过转座子内携带的卡那霉素抗性筛选、氨苄青霉素负筛选、PCR和Southern杂交鉴定转座突变株。在APP与E.coli接合实验中,通过对两亲本接合与三亲本接合进行了比较,证明了两亲本接合的效率明显高于三亲本接合。用两亲本接合方法,构建了32个STM标签的APP突变体库,共得到1652个转座突变菌株(每个标签不少于50个突变体)。2.APP生物被膜形成突变体的筛选及插入失活基因的鉴定用96孔板法和试管法从上述APP血清1型4074-N株(不产生生物被膜)STM突变体库中筛选到两株能产生很强生物被膜的突变体,即STM1-21和STM6-42。提取突变体的基因组用转座子内的SspI酶切后进行自连接。以连接产物为模板,用转座子上的特异性引物STM10/11和STM10/12,通过反向PCR扩增,获得转座子插入位点两侧的基因片段。经DNA测序和BLAST分析,发现这两株突变体均为Mini-Tn10转座子插入失活编码一种类组氨酸核结构蛋白(Histone-like nucleoidstructuring protein)的hns基因造成的。PCR和Southern杂交进一步确定了插入突变体的正确性。3.APP H-NS的结构与功能的初步研究APP的hns基因编码一种135个氨基酸的类核结构蛋白H-NS,主要由三个结构域组成,即N端的聚合结构域、C端的DNA结合结构域和中间的柔性连接片段。通过N端的聚合结构域形成多聚体结构,C端的DNA结合结构域与靶基因结合而发挥调控作用。为了研究APP的hns基因的功能,将4074-N株的hns基因表达盒(包括其编码区、启动子和终止子序列)克隆到能穿梭质粒pJN105中,构建了一个重组表达质粒pJN-hns,分别电转化到hns转座突变菌株STM1-21(M)和亲本菌株4074-N(P)中,期望获得互补菌株(C-3)和过表达菌株(0-2);然后比较分析了上述四个菌株P、M、C-3和O-2的生长特性、生物被膜形成和毒力的变化,结果表明:4个菌株的体外生长速度未见明显差异;除突变菌株M外,其它3个菌株均不能形成可测的生物被膜;菌株M、C-3和O-2对小鼠的毒力和溶血活性均有不同程度的减弱。互补菌株和过表达菌株的上述表型均与预期的结果不一致。为了进一步解释这种现象,我们通过实时荧光定量RT-PCR分析了上述4个菌株中hns基因及两种重要毒力基因axpⅠA和axpⅡA的表达情况。结果显示,hns基因在C-3和O-2菌株中均有表达,但表达量均比亲本菌株P还要低,提示H-NS的缺失在C-3株中并没有得到有效互补,H-NS也没有在O-2株中过表达,C-3和O-2均表现为hns的下调表达菌株,这可能是因为hns基因的表达存在自调控机制,这种表达自调控机制在大肠杆菌中已有报道。此外,axpⅠA和axpⅡA的表达下调也初步解释了菌株M、C-3和O-2的毒力与溶血活性减弱现象。为了进一步研究H-NS蛋白对APP生物被膜形成的影响,本实验以APP血清1型4074株基因组DNA为模板,PCR扩增了408 bp的hns基因编码区,克隆到原核表达载体pET-28c中获得重组质粒pET28c-hns,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导表达和组氨酸亲和层析柱纯化获得大小约19 kD的重组蛋白rH-NS。将不同浓度的rH-NS添加到hns突变株1-21及其亲本菌株4074的培养基中,用微孔板法测定生物被膜的形成。结果显示,在不添加rH-NS时,4074株不能形成可见的生物被膜,而1-21株形成明显的生物被膜;在添加0.1～0.3μmol/L的rH-NS的情况下,1-21株生物被膜的形成量随着rH-NS浓度的升高而降低,而4074株随着rH-NS浓度的升高而升高;rH-NS添加量超过0.4μmol/L对两个菌株生物被膜形成未见明显影响。结果表明H-NS蛋白负调控APP生物被膜的形成,并呈现一定的剂量效应。可见,H-NS作为一种DNA结合蛋白,不仅可以调控其它重要基因的表达,其自身的表达也受到严格的调控。它所调控的靶基因及自身调控机制有待进一步研究。