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目的:目前药物化疗仍然是结直肠癌(CRC)的主要治疗方式之一。耐药是阻碍化疗疗效的主要因素,然而目前对于化疗耐药的机制仍知之不多,研究CRC耐药机制具有重要的理论和临床价值。RAB22A是本课题组前期发现的一个新的候选癌基因,但其在肿瘤耐药中的角色尚不清楚,本研究采用体外实验并结合临床标本分析,阐明RAB22A在CRC耐药中的作用,并探讨其分子机制,以期为CRC的化-疗耐药机制提供新的理论依据,并为逆转肿瘤耐药、改善预后提供新的思路和策略。方法:回顾性收集确诊的、接受以5氟尿嘧啶(5-FU)/奥沙利铂(LOHP)为基础的姑息化疗的晚期CRC病例,采集患者血样和组织病理切片,商业试剂盒分别提取各组血浆外泌体并使用Nanosight NS 300系统检测外泌体粒径和浓度,免疫组化(IHC)技术检测RAB22A蛋白的表达,分析血浆外泌体浓度、肿瘤组织RAB22A表达量和化疗效果的相关性。利用Western blot检测不同CRC细胞的RAB22A表达量,利用商业试剂盒提取等量细胞上清的外泌体并使用Nanosight NS 300系统检测外泌体粒径和浓度,对不同CRC细胞的IC50、RAB22A表达水平以及细胞培养上清中的外泌体的浓度进行相关性分析。构建RAB22A过表达慢病毒质粒p WPXL-RAB22A,通过慢病毒技术构建SW480稳转株SW480-p WPXL-NC(SW480-NC)、SW480-p WPXL-RAB22A(SW480-RAB22A);构建RAB22A敲降慢病毒质粒p LKD-CMV-sh RAB22A,通过慢病毒技术构建SW620稳转株SW620-sh RAB22A及其对照SW620-NC,检测这些CRC稳转株细胞分泌外泌体数量的变化和对化疗药物5-FU和LOHP的IC50变化,流式细胞术检测这些CRC稳转株细胞表面CD63的表达变化,免疫荧光技术观察过表达和敲降RAB22A后CRC细胞分泌外泌体的变化以及RAB22A和外泌体在CRC细胞中的共定位情况。利用基因功能预测工具分析RAB22A的可能效应分子。结果:(1)CRC组织中RAB22A的表达水平与CRC患者血清外泌体的浓度及患者化疗耐药水平之间均有正相关关系;(2)在不同CRC细胞系中,RAB22A的表达水平与细胞耐药能力和分泌外泌体能力均呈现正相关的关系;(3)成功构建过表达及敲降RAB22A的CRC细胞稳转株,与对照细胞相比,SW480-RAB22A细胞中RAB22A上调了(6.62±0.41)倍(P<0.01),SW620-sh RAB22A细胞中RAB22A表达量是对照组的(0.28±0.03)倍(P<0.01)。通过q RT-PCR、WB、药敏、流式细胞术等实验证明在CRC细胞中过表达或敲降RAB22A能够促进或抑制外泌体分泌,进而增强或减弱细胞对化疗药物的耐受能力;(4)利用免疫荧光方法发现RAB22A和外泌体在CRC细胞中存在共定位现象,而且RAB22A表达升高或降低能够促进或抑制外泌体分泌;(5)利用基因功能预测工具分析筛选到21个与RAB22A有潜在相互作用的效应分子,利用不同细胞系中效应基因的表达量、TCGA数据库中CRC患者基因表达谱以及耐药细胞株中效应基因的表达量,进一步筛选到4个潜在的效应基因(CDC14B、EEA1、RAB21和RAB5A);(6)成功构建PRK7-Flag-RAB22A质粒,根据IP实验和质谱结果筛选到6个与RAB22A结合的蛋白(RAB2A、EIF5A2、RAB31、RAB6C、TBC1D15和EEA1)。结论:CRC中RAB22A的表达升高能够促进外泌体的分泌,进而增强CRC细胞化疗耐药。