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竺春等(2006)建立了从猪血清中检测未知病毒的方法,并从义乌某猪场血清中检测到了PPV变异株。其测序结果与日本学者Hijikata等(2001)在缅甸分离到的PPV高度同源。
应用竺春设计的一对特异性检测引物,从浙江金华、义乌、余杭三地猪场血清分别筛查到阳性样品;参照竺春已测定的部分序列和Japan株序列分段设计引物,扩增出1.6 kb、2.4 kb、3.2 kb的片段。经克隆测序、拼接,获得5119 bp近全长的基因组序列,并测定了3个不同猪场来源的3株基因组序列。基因组结构分析表明PPV变异株有两个大的开放阅读框(ORF1,ORF2),ORF1编码661个氨基酸,含有病毒复制相关的保守结构域,为非结构蛋白;ORF2编码1033个氨基酸,在第524-1000位的氨基酸序列含有细小病毒VP2特有的保守结构域。从GenBank选取Japan株及细小病毒科细小病毒属、依赖病毒属、红细胞病毒属的一些毒株,针对ORF1、ORF2氨基酸的同源性进行分析,发现PPV变异株(包括 Japan株)与其他细小病毒的同源性很低,其中与人细小病毒PARV4株的同源性分别为31.4％-31.7％和31.7％-32.1％之间,与传统PPV分别为15.0％-18.0％和9.8％-14.0％之间,与其他细小病毒均在24.2％和25.8％以下;而在4个变异株间的同源性分别为99.1％-99.8％和96.7％-98.8％。通过4株序列比对分析,相应于核苷酸的3500-5000nt位是全基因组核苷酸变异最大的区域,包含于细小病毒VP2基因内。
采集浙江省不同地区的15个猪场共367份猪血清,应用PCR进行了PPV变异株的检测,共检出26份阳性,阳性率仅为7.1％,被检出阳性的猪场有9个,均集中浙江北部中部地区。其中德清、龙游、义乌PPV变异株检出阳性率稍高,分别为20％(4/20)、20％(6/30)和17.2％(5/29)。根据4株序列比对分析显示的高变区,设计引物vp2-up、vp2-dn,扩增位于3386-5119 nt之间、长1734 bD、共编码578个氨基酸的片段(vVP2)。按照一个猪场选取两份阳性样品的原则,分别PCR扩增了9株vVP2片段,加上原来已测的3株序列,共获得12条浙江毒株的vVP2序列。分析表明浙江毒株与Japan株的核苷酸同源性91.90％-92.6％,浙江毒株间96.1％-99.8％。对13株己测的序列(包括 Japan株)分析,发现775-810 nt是变异集中的区域,在该区域范围,Japan株和浙江株的核苷酸同源性61.1％-69.4％,浙江毒株间在72.2％-100.0％之间。通过选择压力分析,推测775-810 nt编码的氨基酸可能经受筛选压力。系统进化树显示浙江毒株和Japan株分成两个分支,其中浙江毒株有两种不同的亚型A和B,但有相同猪场来源的毒株在不同的亚型。