研究背景:抑郁症(Major depression disorder,MDD)是一种基因与环境交互影响的重大精神疾病。全球抑郁症的发生率约为3.1%,我国抑郁症的患病率约为6.87%,约有9000万抑郁症患者。通过对抑郁症发病机制的深入研究,发现抑郁症不仅仅是与神经递质紊乱相关的一种神经精神系统疾病,而是一种多致病因素相互作用的复杂共病体系。肠道微生物紊乱在复杂疾病中的发病机制已成为近年来国际关注焦点。目前肠道微生物在精神病学、神经发育、神经再生及神经退行性等疾病的病理生理机制方面探索方兴未艾,肠道微生态对于维持生物体内平衡的重要性已毋庸置疑,已有诸多研究证实,肠道微生物可与大脑进行双向调控。我们项目组前期研究发现抑郁症患者伴有肠道微生物紊乱,并通过粪便移植实验建立了抑郁“人源化”动物模型,行为学测试结果提示移植抑郁症患者粪便的无菌小鼠表现出抑郁样行为,初步证实肠道微生物紊乱是抑郁症的潜在病因,为抑郁症研究提供了全新线索,然而其具体致病机制仍然不清楚。蛋白质磷酸化修饰在生命体中具有十分重要的作用。磷酸化是通过蛋白质激酶将ATP的磷酸基转移到蛋白质丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上的过程。磷酸化作为一种分子开关,能够动态调节酶活性及蛋白-蛋白相互作用,可形成一系列蛋白质次序磷酸化的级联反应将细胞信号快速传递,因而广泛存在于各种细胞内信号传导途径。抑郁症患者尸检脑组织标本磷酸化蛋白质组学研究发现,抑郁症患者前额叶组织中有90种蛋白质存在磷酸化修饰水平变化,且蛋白质磷酸化修饰变化主要涉及突触结构和功能重塑。因此。我们提出肠道微生物紊乱是否是通过蛋白质磷酸化修饰改变这一途径诱导抑郁障碍的关键科学问题。目的:探讨肠道微生物紊乱是否是通过蛋白质磷酸化修饰水平改变的途径诱导抑郁障碍的发生和发展,然后进一步通过对差异磷酸化蛋白的进一步分析,发现关键致病通路和潜在干预靶点。方法:1.构建“人源化”小鼠抑郁模型,在粪便菌群定植两周后进行行为学测试及取材。2.采用TMT标记联合LC-MS/MS技术分别对8只GF小鼠、8只SPF小鼠和6只“人源化”抑郁小鼠及6只“人源化”对照小鼠的海马组织磷酸化修饰蛋白表达水平进行检测,根据差异倍数值(fold change,FC)大于1.5或小于0.67,及p值小于0.05筛选差异磷酸化修饰位点。3.采用生物信息学方法对差异磷酸化修饰肽段进行共同基序分析,预测磷酸化修饰激酶,并对差异磷酸化修饰蛋白进行功能注释、通路分析及蛋白-蛋白互作分析。4.使用蛋白免疫印迹实验方法(WB)用于验证在人源化肠道菌群紊乱模型海马中的CaMKII-α,HSPA8,PKC和FAK的蛋白表达量。5.整合“人源化”小鼠抑郁模型的磷酸化蛋白和代谢物数据、抑郁动物模型脑组织及抑郁症患者尸检脑组织磷酸化修饰蛋白组学数据,寻找肠道微生物紊乱诱导抑郁的关键通路,寻找抑郁障碍关键致病机制。结果:1.与SPF小鼠相比,GF小鼠在强迫游泳实验中的静止不动时间显著缩短;在旷场实验中,GF小鼠中心运动距离较SPF小鼠显著增加,提示GF小鼠与SPF小鼠相比,出现明显的抗抑郁、抗焦虑样行为。“人源化”抑郁小鼠与“人源化”对照小鼠相比,“人源化”抑郁小鼠在旷场实验中的中心运动距离减少;在强迫游泳实验中,“人源化”抑郁小鼠的静止不动时间显著延长,提示出现抑郁和焦虑样行为。2.在GF/SPF小鼠海马组织中,鉴定到了237个蛋白的327个磷酸化修饰位点存在显著差异;在“人源化”小鼠组小鼠海马组织中,我们鉴定到了334个蛋白的478个磷酸化修饰位点有显著差异。3.差异磷酸化修饰肽段基序分析结果显示,在GF比SPF小鼠中,Rxxs,sP,sxE和sxD磷酸化修饰基序具有显著意义,其中Rxxs是最保守的修饰基序,其可被CaMKII,PKA和PKC激酶修饰;在“人源化”抑郁小鼠比“人源化”对照小鼠中,sP,Rxxs,sxxE和tP磷酸化修饰基序具有显著意义,其中sP是最保守的修饰基序,其可被GSK-3,ERK1/2和CDK5激酶修饰。4.在肠道微生物紊乱小鼠海马组织中,存在谷氨酸能神经递质功能紊乱,CAMKII-CREB信号通路是改变最显著的共同通路。Western Bloting验证结果发现,在“人源化”抑郁小鼠与“人源化”对照小鼠相比,其海马中CaMKII-α,HSPA8,PKC和FAK蛋白表达量没有差异。5.整合“人源化”小鼠抑郁模型的磷酸化蛋白和代谢物数据、抑郁动物模型脑组织及抑郁症患者尸检脑组织磷酸化修饰蛋白组学数据结果表明,肠道微生物紊乱可能通过宿主脂质代谢和氨基酸代谢介导的相关通路诱导相关行为表型;抑郁障碍发病可能与神经轴突导向功能障碍有关。结论:1.肠道微生物紊乱小鼠海马的蛋白磷酸化修饰水平改变显著,肠道微生物紊乱可能是通过蛋白质磷酸化修饰改变从而诱导抑郁障碍。2.肠道微生物紊乱诱导抑郁样行为小鼠存在谷氨酸能神经递质功能紊乱,CAMKII-CREB信号通路是改变最显著的共同通路。3.研究首次发现肠道菌群失调会引起剪接体功能紊乱和关键蛋白NCBP1可能是肠道微生物紊乱影响中枢功能和行为的一个全新特异性致病靶点。4.整合“人源化”小鼠抑郁模型的磷酸化蛋白和代谢物数据、抑郁动物模型脑组织及抑郁症患者尸检脑组织磷酸化修饰蛋白组学数据,发现脂质代谢和氨基酸代谢紊乱和神经轴突导向功能可能是介导肠道微生物诱导抑郁的关键途径。5.研究为探究抑郁症的病理机制提供了一个全新视角,并为探索基于肠道微生物干预的抑郁症治疗手段提供了可能的理论依据及潜在的新靶点。研究背景:近年来,随着人类微生物组计划的启动,关于肠道微生物与不同疾病之间相互作用的研究越来越多,肠道微生物相关研究成为了当今全球生命科学研究的热点和焦点,肠道微生物对人类健康和疾病的发生具有重要意义。项目组前期大量研究已证实肠道微生物紊乱可诱导抑郁障碍,同时有研究提示在重度抑郁障碍和创伤后应激障碍患者中,嗅觉功能障碍与嗅球体积减小相关,肠道微生物可影响嗅觉上皮细胞发育,在使用无菌小鼠的前期研究发现,肠道微生物可以参与调控嗅觉上皮细胞的生理机能,肠道微生物的缺失可导致纤毛层变薄,同时与嗅觉功能传导途径相关的基因表达降低。因此,我们假设肠道微生物失调可能通过宿主与肠道微生物的相互作用从而影响嗅球的生物化学及嗅觉功能,但具体生物学机制尚不明确,经查阅文献发现,肠道微生物可通过改变宿主代谢物表达水平影响宿主的嗅觉信号传导系统。为进一步探究肠道微生物影响嗅球功能障碍的分子机制,我们开展了本研究。目的:1、明确肠道微生物的缺失是否会影响小鼠嗅觉功能。2、探索肠道微生物紊乱影响嗅觉功能的代谢分子机制。方法:我们采用食物包埋实验对成年雄性无菌鼠(Germ-free,GF)和无特定病原体小鼠(Specific pathogen free,SPF)的嗅觉功能进行了对照研究。然后采用气相色谱-质谱联用(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)对GF和SPF小鼠嗅球(Olfactory bulb,OB)的代谢谱进行检测和比较,以进一步探究嗅觉功能障碍的相关机制。结果:我们研究发现肠道微生物的缺失会影响小鼠嗅觉功能及嗅球的代谢特征。在GF和SPF两组小鼠嗅球中共有38个代谢物质具有显著性差异。这些差异代谢物质主要与糖酵解、三羧酸循环(Tricarboxylic acid,TCA)、氨基酸代谢和嘌呤分解代谢紊乱相关。最后,我们对肠道微生物紊乱相关的代谢物改变、蛋白质改变和m RNA表达改变进行了整合分析,成功构建了基于肠道微生物调控嗅觉功能障碍的代谢网络。结论:本研究结果表明,肠道微生物的缺失会影响小鼠嗅觉功能和嗅球代谢网络特征。该研究将为解析嗅觉功能障碍相关疾病及其潜在机制提供一个全新的切入点和理论支撑。