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目的:探讨盐酸米托蒽醌(mitoxantrone hydrochloride,MIT)对B16细胞钙网蛋白(CRT)表达的影响,观察高表达CRT的黑素瘤B16细胞膜抗原疫苗对小鼠抗肿瘤免疫反应所产生的影响;同时观察高表达CRT的B16细胞膜抗原冲击后DCs诱导的CTL细胞对荷黑素瘤小鼠的治疗效果。方法:用MIT处理B16细胞,免疫荧光法检测B16细胞膜表面CRT的表达,检测得知MIT可以上调B16细胞CRT的表达。分别用不同剂量的MIT治疗荷瘤小鼠,用普通B16细胞膜抗原和MIT处理过的B16细胞膜蛋白作为疫苗对荷瘤小鼠模型进行预防接种。体外用普通B16细胞膜抗原和MIT处理过的B16细胞膜抗原分别冲击DCs之后诱导特异性CTLs治疗荷瘤小鼠。流式细胞学观察小鼠肿瘤组织中CRT表达,脾脏不同T细胞比例变化,免疫组化检测小鼠肿瘤内T淋巴细胞、DCs的浸润情况,描计小鼠肿瘤体积曲线,观察对荷黑素瘤小鼠的治疗效果。结果:1.分别用0.0μg/ml、0.25μg/ml、1.0μg/ml、4.0μg/ml浓度MIT处理B16细胞,4组肿瘤细胞CRT的表达阳性率分别为:(29.40±3.57)%;(42.80±4.59)%;(56.20±5.55)%;(72.20±2.94)%,CRT表达均上调(P<0.05),且CRT表达呈剂量依赖性(P<0.05)。Western blotting鉴定显示,4.0μg/ml浓度MIT组B16细胞膜CRT相对表达为472±23,0.0μg/ml MIT组B16细胞膜CRT相对表达为117±18(P<0.01)。2.用2.0、4.0、8.0 mg/kg MIT注射治疗荷瘤小鼠,与对照组相比3种剂量MIT可以不同程度可以提高小鼠模型肿瘤组织CRT表达,流式细胞学检测其CRT表达量分别为:5.13±0.95; 7.40±0.86;9.17±1.06,与对照组3.21±1.37相比有显著差别(P<0.05)。3.免疫组化实验显示:2.0、4.0、8.0 mg/kg MIT组和MIT-B16蛋白疫苗组小鼠模型肿瘤组织内部的DCs数量均显著高于荷瘤对照组小鼠(P<0.05);2.0、4.0 mg/kg MIT组和MIT-B16蛋白疫苗组小鼠模型肿瘤组织内部的T细胞数量均显著高于荷瘤对照组小鼠(P<0.01)4.流式细胞学检测小鼠脾脏T淋巴细胞显示:4.0 mg/kg MIT组、MIT-B16蛋白疫苗组、B16-DCs-CTLs组、MIT-B16-DCs-CTLs组小鼠脾脏中CD4~+T淋巴细胞比例与荷瘤小鼠相比有显著提高(P<0.01);2.0、4.0、8.0 mg/kg MIT组、MIT-B16蛋白疫苗组、B16-DCs-CTLs组、MIT-B16-DCs-CTLs组小鼠脾脏中CD8~+T淋巴细胞比例与荷瘤小鼠相比有显著提高(P<0.05)5.第14日处死小鼠测量肿瘤体积(cm3),各实验组肿瘤体积均明显小于与荷瘤对照组小鼠6.94±0.81(P<0.01),其中2.0、4.0、8.0 mg/kg MIT组小鼠肿瘤体积分别为4.07±0.77、2.35±0.54、1.21±0.39,3组有明显差别(P<0.05);B16蛋白疫苗组,MIT-B16蛋白疫苗组肿瘤体积分别为4.15±0.57、1.67±0.33,2组有明显差别(P<0.05);B16-DCs-CTLs组、MIT-B16-DCs-CTLs组肿瘤体积分别为:1.09±0.25、0.59±0.21,2组有明显差别(P<0.05);其中各治疗组中MIT-B16-DCs-CTLs组肿瘤体积均小于其他各组(P<0.05)。结论:1. MIT能够上调CRT在B16肿瘤细胞表面的表达,相似的MIT可以提高小鼠黑色素瘤组织中CRT的表达,且在小鼠承受的范围内CRT表达呈现剂量依赖性;适当剂量的MIT能够提高小鼠黑色素瘤组织中浸润的DCs和T细胞的数量,提高小鼠脾脏中CD4~+、CD8~+T淋巴细胞比例,形成特异性的抗肿瘤免疫。2.高表达CRT的B16细胞膜蛋白疫苗能够提高肿瘤组织中浸润的DCs和T细胞的数量,提高小鼠黑色素瘤组织中浸润的DCs和T细胞的数量,提高小鼠脾脏中CD4~+、CD8~+T淋巴细胞比例,改善小鼠机体抗肿瘤免疫环境,对小鼠产生肿瘤特异性保护。3.利用高表达CRT的B16肿瘤膜抗原冲击后的DCs-CTLs细胞治疗荷瘤小鼠,小鼠脾脏中CD4~+、CD8~+T淋巴细胞比例提高,改善小鼠机体抗肿瘤免疫环境,能够取得理想疗效。