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胃癌在全球范围内的高发病率和死亡率使其成为严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一。即便近年来出现了多种胃癌新型化疗药物,治疗方案也不断改进,但大多数胃癌患者在确诊时往往已经处于疾病中晚期阶段,随后病程呈现进展快、预后差的特点,且确诊后5年生存率也较低。随着肿瘤发生和转移过程中分子生物学、分子病理学研究的深入发展,分子靶向治疗或成为继手术及化疗、放疗后的一种新型治疗手段,然而这些靶向药物的调控机制还未阐明,目前仍然缺乏早期诊断的生物标志物,关于胃癌发生发展的具体分子机制仍旧存在诸多疑问。我们前期的研究结果表明,胰岛素增强子结合蛋白-1（Insulin gene enhancer binding protein-1,ISL1）在胃癌中异常高表达,并与肿瘤TNM分期、淋巴结转移以及总体生存率相关,进一步研究发现,ISL1能够明显促进胃癌细胞增殖、肿瘤生长、细胞迁移和侵袭。但其在胃癌中的具体调控机制还需要进一步研究。[目 的]本研究旨在探究ISL1促进胃癌细胞增殖和细胞迁移的具体分子机制,并筛选出调控ISL1表达的上游miRNA分子,为进一步研究ISL1这一经典转录因子在肿瘤中的相关功能打下基础,也为提高胃癌的诊断、预后和治疗提供理论基础。[方法]1.通过在线数据库 PITA、TargetScan、PicTar、microT、miRmap、miRDB 查找对ISL1有调控作用的上游miRNA分子。2.通过Western blot实验检测胃癌细胞系MGC803、MKN45、BGC823和正常胃黏膜上皮细胞系GES1中ISL1的蛋白表达水平,筛选ISL1高表达的细胞系作为后续研究体系。3.通过RT-qPCR实验检测ISL1高表达细胞和ISL1相对低表达细胞中的miRNA分子水平,初步筛选可能调控ISL1的miRNA分子。4.利用miRNA分子的过表达序列mimics,在胃癌细胞MGC803中分别瞬时过表达 miRNA219a-5p、miRNA29a-3p 和 miRNA371b-5p,通过 RT-qPCR 实验检测过表达效果,Western blot实验检测ISL1蛋白表达水平。利用miRNA分子的抑制序列inhibitors,在胃癌细胞MGC803中分别瞬时抑制miRNA219a-5p、miRNA29a-3p 和 miRNA371b-5p,通过 Western blot 实验检测ISL1 蛋白表达水平。5.通过在线数据库 TargetScan 查找 miRNA219a-5p、miRNA29a-3p 和miRNA371b-5p与ISL1相互作用序列信息,构建双荧光素酶报告基因质粒,进行双荧光素酶报告基因实验,检测miRNA219a-5p、miRNA29a-3p和miRNA371b-5p是否与ISL1直接作用。6.通过GEO数据库分析胃癌组织中miRNA219a-5p表达水平,通过RT-qPCR实验检测10例胃癌组织中miRNA219a-5p表达水平。7.通过在胃癌细胞MGC803中瞬时转染miRNA219a-5p的质粒,进行细胞划痕修复实验,检测过表达miRNA219a-5p对胃癌细胞迁移能力的影响。通过在胃癌细胞MGC803中瞬时转染miRNA219a-5p和ISL1的质粒,进行细胞划痕修复实验,检测共同表达miRNA219a-5P和ISL1对胃癌细胞迁移能力的影响。8.通过在胃癌细胞MGC803中瞬时转染miRNA219a-5p的质粒,进行cck-8实验,检测过表达miRNA219a-5p对胃癌细胞增殖能力的影响。进行细胞克隆形成实验,检测过表达miRNA219a-5p对胃癌细胞克隆形成能力的影响。[结 果]1.通过在线数据库的预测,初步筛选出17个可能参与调控ISL1表达的miRNA分子。Western blot实验发现,与正常胃黏膜上皮细胞系GES1相比ISL1的蛋白表达水平在胃癌细胞系MGC803中显著上调,胃癌细胞系MKN45和BGC823中ISL1蛋白表达水平相对较低,因此选择胃癌细胞系MGC803作为ISL1异常高表达的研究体系。通过RT-qPCR实验发现,与ISL1低表达的细胞系 GES1、MKN45 相比,miRNA219a-5p、miRNA29a-3p 和 miRNA371b-5p 的表达水平在ISL1异常高表达的胃癌细胞系MGC803中显著降低。2.通过Western blot实验发现,相对于对照组nc,在胃癌细胞MGC803中瞬时过表达miRNA219a-5p后,瞬时过表达miRNA219a-5p组的ISL1 mRNA水平和蛋白水平都显著降低,瞬时过表达miRNA29a-3p组,ISL1的mRNA水平和蛋白水平轻度降低,瞬时过表达miRNA371b-5p组,ISL1的mRNA水平升高,而蛋白水平无明显变化。3.通过双荧光素酶报告基因实验发现,miRNA219a-5p可以结合在ISL1 mRNA的3’ UTR区,显著抑制荧光素酶活性,miRNA29a-3p可以结合在ISL1 mRNA的3’ UTR区,轻度抑制荧光素酶活性,miRNA371b-5p不能结合在ISL1 mRNA的3’ UTR区,对荧光素酶活性无明显影响。4.基于GEO数据分析结果显示miRNA219a-5p在胃癌组织中的表达水平显著低于正常胃黏膜组织。RT-qPCR实验发现,相对于正常胃黏膜组织,ISL1的表达水平在7例胃癌组织中表达下调,在3例胃癌组织中表达上调。5.和对照质粒sh nc相比,瞬时过表达miRNA219a-5p的胃癌细胞横向迁移能力显著减弱,而当同时过表达它的下游靶蛋白ISL1后,胃癌细胞横向迁移能力得以部分恢复。6.与对照质粒sh nc相比,瞬时过表达miRNA219a-5p的胃癌细胞增殖能力和克隆细胞形成数目均无明显变化。[结论]1.在ISL1高表达的胃癌细胞系中miRNA219a-5p、miRNA29a-3p和miRNA37 1b-5p 表达下调。2.miRNA219a-5p可以结合在ISL1 mRNA的3’UTR区,抑制下游靶蛋白ISL1的表达,从而抑制胃癌细胞的迁移能力。