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背景和目的 1919年Rio-Hortega第一次描述小胶质细胞以来,小胶质细胞（Microglia）被认为是中枢神经系统的巨噬细胞,来源于造血干细胞。小胶质细胞占中枢系统细胞10-15%,作为寄居在中枢神经系统的免疫细胞,时刻监督脑内损伤的神经元、感染和斑块,当大脑受到损伤或者出现病理状态,小胶质细胞立刻从分枝的静息状态快速向阿米巴样的活化状态转化,呈现所谓的激活状态。当小胶质细胞处于激活状态,吞噬功能增强,细胞表面的MHC, CD14, CD40, CD80, CD86等表面分子上调,释放NO, IL-1, IL-6和TNF-a等促炎症介质吸引外周免疫细胞到达中枢神经系统,通过表面受体与外周免疫细胞结合,共同参与天然免疫和获得性免疫反应。小胶质细胞的激活和炎症介导的神经毒性在神经退行性疾病进程中扮演者重要角色,大量研究证实持续的小胶质细胞炎症反应对神经元是有毒性的,如阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）、多发性硬化（Multiple sclerosis, MS）和帕金森（Parkinson’s disease, PD）。 CRH（Corticotropin-releasing hormone, CRH）及其受体是HPA（Hypothalamus-pituitary-adrenal, HPA）轴主要的调节因子,在皮层和海马区域参与调节神经元活动。CRH通过其受体参与体内各种生理功能,受体CRHR分CRHR1和CRHR2, CRHR是7次跨膜结构的G蛋白偶联受体,两种受体在大脑及外周神经系统广泛分布,CRHR1主要分布在皮层、海马、小脑和感觉相关结构,CRHR2主要表达在一些皮层下结构,如黑质区域。CRH结合两个G蛋白偶联受体CRH-R1和CRH-R2,通过cAMP、PKC或MAPK信号途径途,发挥生物学效应。很多研究现实应激产生的CRH参与了多种多种神经系统疾病疾病的发病进程,如AD疾病,PD伴随抑郁症。AD病人大脑中发现,CRH急剧减少,相反CRH受体上调,CRH神经元形态异常,最新一项研究发现,CRH加剧神经病理性病变和认知减退。CRH除了参与神经退行性疾病的疾病进程,同时也直接调节免疫炎症反应。现在已经证实CRH通过自分泌或旁分泌方式影响免疫细胞的功能,扮演促进炎症的角色。CRH加剧LPS导致的巨噬细胞炎症因子TNF-a和IL-6的mRNA基因合成。CRH家族的UCN（Urocortins）抑制LPS诱导的小胶质细胞的激活。CRH通过其受体调节CREB和MAPK的磷酸化,从而调节NF-κB, NF-κB参与调节炎症因子的合成和释放,如IL-6、TNF-α等炎症介质,CRH结合CRHR1激活粒细胞中的NF-κB活性,产生炎症介质,参与免疫炎症反应。在体和体外研究证实,CRH对神经元的损伤和消失都具明显重要作用。但是在中枢系统CRH是否参与调节小胶质细胞的促炎症因子的释放和小胶质细胞的激活,至今研究的不是很清楚。 因此本研究试图通过体外培养新生SD大鼠皮层的小胶质细胞,通过吞噬能力测试、NO测试、流式细胞技术、ELISA和RT-PCR等方法证实CRH是否参与小胶质细胞激活以及促炎症因子TNF-α和IL-6分泌并探讨可能的分子机制。 实验设计和方法 体外培养新生1-2天SD大鼠皮层小胶质细胞,培养10天后,将小胶质细胞纯化培养16-24小时后,加入不同浓度的CRH刺激小胶质细胞,检测小胶质细胞吞噬功能和NO、TNF-α和IL-6的产生。LPS （10ng/ml）作为阳性实验对照。 实验结果 1.CRH促进原代培养的大鼠皮层小胶质细胞的吞噬能力。在原代小胶质细胞加大不同浓度的CRH（10-10mol/l,10-12mol/l,10-15mol/l）孵育6小时,CRH（10-15mol/l,10-12molA,10-10mol/l）吞噬功能高于空白对照组,但与对照组比较无显著性差异。在原代小胶质细胞加入不同浓度的CRH （10-10mol/l,10-12mol/l,10-15mol/l）预孵育30min后,再加入LPS （10ng/ml）孵育6小时,小胶质细胞吞噬功能高于LPS（10ng/ml）对照组,但无显著性差异。 2.CRH促进原代培养的大鼠皮层小胶质细胞产生NO。在原代小胶质细胞加入不同浓度的CRH （108mol/l,10-9mol/l,10-10mol/l,10-12mol/l,10-15mol/l）孵育24小时,其中只有1015mol/lCRH明显促进NO生成,和空白对照组相比,有显著性差异（P＜0.001vs. control）。在原代小胶质细胞加入不同浓度的CRH （10-8mol/l,10-9mol/l,10-10mol/l,10-12mol/l,10-15mol/l）预孵育30min后加入LPS （10ng/ml）孵育24小时,只有10-15mol/l CRH可以促进LPS诱导的NO生成,与LPS（10ng/ml）对照组比较,有显著性差异（P＜0.001vs. LPS treatment）. 3.CRH促进原代培养的大鼠皮层小胶质细胞分泌TNF-a和IL-6。在原代培养的小胶质细胞中加入不同浓度的CRH （10-8mol/l,10-9mol/l,10-10mol/l,10-12mol/l,10-15mol/l）孵育24小时,其中10-15mol/lCRH明显促进生成TNF-a和IL-6的分泌,和空白对照组比较,有显著性差异（P＜0.001vs. control）.在原代小胶质细胞加入不同浓度的CRH （10-8mol/l,10-9mol/l,10-10mol/l,10-12mol/l,10-15mol/l）预孵育30min后加入LPS （lOng/ml）孵育24小时,10-15mol/l CRH可以促进LPS诱导的TNF-a和IL-6生成,与LPS（10ng/ml）对照组比较,有显著性差异（P＜0.001vs. LPS treatment）,其中10-12mol/lCRH也能刺激小胶质细胞分泌IL-6,与LPS组相比,有显著性差异（P＜0.01vs. LPS treatment）. 4.CRH诱导小胶质细胞的激活反应可被CRHR1特异性拮抗剂CP154,526（1pM）, p＜0.001vs.10-15mol/l CRH group.同时CRH诱导小胶质细胞的激活反应可被P38/MAPK拮抗剂SB203580（10μM）, p＜0.001vs10-15mol/l CRH group.运用cAMP拮抗剂Rp-8-Br-cAMP可以拮抗CRH诱导小胶质细胞的激活反应,p＜0.001vs.10-15mol/l CRH group. 5.CRH增强LPS诱导的小胶质细胞的激活反应可被CRHR1特异性拮抗剂CP154,526（1pM）, p＜0.01vs.10-15mol/l CRH+LPS group.同时CRH诱导小胶质细胞的激活反应可被P38/MAPK拮抗剂SB203580（10μM）, p＜0.001vs10-15mol/l CRH+LPS group.运用cAMP拮抗剂Rp-8-Br-cAMP （20μM）不能拮抗CRH增强LPS诱导的小胶质细胞的激活反应。 小结 CRH轻微原代培养的大鼠皮层小胶质细胞的吞噬能力,刺激小胶质细胞产生NO,分泌促炎症因子IL-6和TNF-α。CRH促进LPS诱导的小胶质细胞激活以及NO和促炎症因子IL-6和TNF-a的释放。提示CRH参与中枢神经系统小胶质细胞的激活,起促炎症的角色,可能参与神经退行性疾病、低氧损伤和缺氧缺血疾病病程过程的小胶质细胞功能调节。