目的:研究我院肺炎克雷伯菌耐药状况,分析肺炎克雷伯菌生物膜形成能力,并探讨外排泵基因acr A、kex D、oqx B、kde A、kpn E携带情况、生物膜状态下kex D、kde A、kpn E外排泵基因表达情况及外排泵抑制剂氰化羰基-3-氯苯腙(CCCP)对肺炎克雷伯菌生物膜产生的影响,为进一步了解生物膜产生与耐药的机制提供实验依据,为研究抗生物膜疗法提供帮助。方法:1.收集大连医科大学附属第一医院检验科微生物室2019年1月至2019年7月的部分肺炎克雷伯菌临床分离株,采用Micro Scan Walk Away 96Plus全自动细菌鉴定及药敏分析仪进行鉴定及药敏测定,分析菌株对临床常见抗生素的耐药情况。2.应用结晶紫染色法检测肺炎克雷伯菌生物膜形成情况,并用共聚焦激光扫描显微镜观察生物膜结构,分析肺炎克雷伯菌生物膜形成能力与碳青霉烯类抗生物耐药性的相关性。3.PCR检测肺炎克雷伯菌外排泵基因acr A、kex D、oqx B、kde A、kpn E携带情况,分析肺炎克雷伯菌携带外排泵基因种类与生物膜及碳青霉烯类耐药性间相关关系。4.随机选取23株携带以上外排泵基因的生物膜阳性肺炎克雷伯菌,体外构建生物膜,RT-PCR检测外排泵基因kex D、kde A、kpn E在生物膜状态和浮游状态的相对表达情况。5.采用结晶紫染色法检测CCCP对11株肺炎克雷伯菌生物膜形成的影响。结果:1.110株肺炎克雷伯菌其中对氨苄西林属于天然耐药,耐药率为100%。对头孢唑啉、头孢噻肟、头孢曲松、头孢呋辛耐药率在70%以上,氨苄西林/舒巴坦、头孢吡肟、氨曲南、头孢他啶、环丙沙星、头孢哌酮/舒巴坦的耐药率在60%以上,哌拉西林他唑巴坦、头孢西丁、左氧氟沙星、对亚胺培南、美罗培南、厄他培南、复方新诺明耐药率在50%以上,对庆大霉素耐药率为46%,而对妥布霉素、阿米卡星、替加环素耐药率较低,分别为32%、25%和2%。110株肺炎克雷伯菌临床分离株中包括58株碳青霉烯类耐药株,而非碳青霉烯类耐药株为52株。2.110株肺炎克雷伯菌生物膜形成能力不尽相同,其中有63株肺炎克雷伯菌生物膜形成能力较强,20株生物膜形成能力中等,19株生物膜形成能力较弱,还有8株认定为无生物膜形成能力。共聚焦激光扫描显微镜下观察可见生物膜强阳性菌株细菌分布密集,聚集成片,形成明显膜状结构。肺炎克雷伯菌碳青霉烯类抗生物耐药株与敏感株的生物膜形成能力存在显著性差异。3.外排泵基因acr A、oqx B、kde A、kpn E在110株肺炎克雷伯菌中的检出率较高,超过90%,而kex D外排泵基因的检出率最低为72.73%。统计分析发现,肺炎克雷伯菌生物膜形成能力与携带外排泵基因种类无明显统计学相关,而肺炎克雷伯菌碳青霉烯类药物耐药组与敏感组所携带的外排泵基因种类存在显著差异性。4.肺炎克雷伯菌生物膜菌和浮游菌kpn E和kex D基因的相对表达量存在显著性差异性(kpn E:P值<0.05,kex D:P值<0.01),而外排泵基因kde A在两种状态下表达无明显差异(P值>0.05)。5.当CCCP浓度达到8ug/ml时,大多数肺炎克雷伯菌生物膜的形成情况明显下降。结论:1.本院临床分离的肺炎克雷伯菌耐药情况严峻,超一半肺炎克雷伯菌为多重耐药,尤其是对碳青霉烯类抗生素美罗培南、厄他培南、亚胺培南的耐药率高达54%,仅对妥布霉素、阿米卡星、替加环素耐药率较低。2.肺炎克雷伯菌生物膜阳性率较高,碳青霉烯类药物耐药株与敏感株的生物膜形成能力有明显差异。3.肺炎克雷伯菌外排泵基因检出率高,大多数肺炎克雷伯菌携带4种以上外排泵基因,肺炎克雷伯菌碳青霉烯类抗生素耐药菌株与敏感菌株相比携带外排泵基因种类存在差异性。4.生物膜状态下外排泵基因kex D和kpn E相对表达量升高,一定浓度的外排泵抑制剂CCCP可抑制肺炎克雷伯菌生物膜形成,因此外排泵基因可能与肺炎克雷伯菌生物膜形成相关。