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本文主要从以下三个部分展开论述： 第一部分: 目的:脑缺血后小胶质细胞被激活并进入细胞周期而增殖,进而加重缺血性损伤,小胶质细胞从而成为一个缺血性脑血管疾病潜在的治疗靶点。本部分研究试图探讨细胞周期抑制剂roscovitine对局灶性脑缺血后小胶质细胞的细胞周期的影响,为细胞周期调控在CNS的进一步研究应用提供实验依据。 方法:建立体外培养小胶质细胞细胞系 BV2细胞氧糖剥夺(Oxygen and glucose deprivation,OGD)离体培养模型,分为对照组、OGD组和roscovitine干预组,用流式细胞仪检测OGD后不同时间点 BV2细胞细胞周期的变化。实验动物随机分为假手术组、脑缺血组和roscovitine干预组,建立大脑中动脉栓塞模型(middle carotid artery occlusion,MCAo),分别于损伤后1d、3d和7d于麻醉状态下断头取脑,利用免疫组织化学技术检测脑缺血后后小胶质细胞的活化增殖情况,利用免疫荧光双标技术和western blot技术检测细胞周期相关蛋白(cyclin A, cyclin B、cyclin E以及Ki67)的表达水平变化。 结果:OGD后1h, S期的BV2细胞较之对照组明显增加(OGD组54.8±0.34,对照组15.6±1.35,P<0.05),当给予roscovitine干预后,G0/G1期的细胞比例呈现逐渐增高的趋势,S期的细胞比例少于OGD组(P<0.05)。假手术组中小胶质细胞多处于静息状态,细胞周期相关蛋白的表达较弱;脑缺血后小胶质细胞明显活化增殖,Ki67阳性小胶质细胞阳性率为18.3±0.35％,细胞周期相关蛋白的表达显著升高;给予 roscovitine干预后小胶质细胞的活化增殖被显著抑制, Ki67阳性小胶质细胞阳性率为10.3±0.12%,细胞周期相关蛋白的表达明显降低。 结论:小胶质细胞具有完整的细胞周期,缺血缺氧可以诱导小胶质细胞进入细胞周期,CDK抑制剂 roscovitine可通过降低脑缺血后细胞周期相关蛋白的表达,进而抑制小胶质细胞的活化增殖而调控其细胞周期。 第二部分: 目的:小胶质细胞作为CNS组织内主要的免疫细胞,在脑缺血后被大量激活并释放多种致炎细胞因子而加重炎性损伤,并促进神经元胞的凋亡。由于小胶质细胞为可分裂细胞,其活化增殖受细胞周期的密切调控。本部分研究试图探讨细胞周期抑制剂 roscovitine对脑缺血后小胶质细胞活化增殖合成分泌相关炎症因子(IL-1β、MIP-1α和NO)的影响,为细胞周期调控在CNS的进一步研究应用提供实验依据。 方法:实验动物随机分为假手术组、脑缺血组和roscovitine干预组,建立MCAO模型,分别于缺血后1d、3d、7d处死,断头取脑,利用免疫组织化学技术检测脑缺血后小胶质细胞的表达炎性因子IL-1β、MIP-1α和诱导型一氧化氮合酶的情况,利用 western blot技术检测相关蛋白(IL-1β、MIP-1α)表达水平变化,并检测组织中 NO的含量。利用TUNEL技术检测神经元凋亡变化,TTC染色计算梗死灶体积,并比较了各实验组之间的神经功能评分。 结果:假手术组中IL-1β、MIP-1α和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达较弱,小胶质细胞多处于静息状态;脑缺血后后IL-1β、MIP-1α和iNOS的表达显著升高,小胶质细胞明显活化增殖,有明显梗死灶形成,神经元凋亡增多,神经功能评分升高;给予roscovitine干预后IL-1β、MIP-1α和iNOS的表达明显降低,小胶质细胞的活化增殖被显著抑制,梗死灶体积减小,神经元凋亡减少,神经功能评分降低(p<0.05)。 结论:CDK抑制剂roscovitine可通过抑制小胶质细胞的活化增殖和相关致炎因子的产生,减少神经元凋亡,减小梗死体积,改善神经功能评分,提示细胞周期调控可能是未来脑缺血治疗的一个新的举措。 第三部分: 目的:观察局灶性脑缺血后海马和缺血边缘区星型胶质细胞过度增殖对微循环的影响。 方法:将大鼠随机分为假手术组、缺血组和干预组,缺血组和干预组采用线栓法制备大脑中动脉栓塞模型,缺血组侧脑室采用ALZET微渗透泵给予0.2%DMSO,干预组给予细胞周期抑制剂roscovitine。缺血7d后于股静脉注入FITC标记的葡聚糖标记血管,小鼠抗大鼠单克隆抗胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗体标记星型胶质细胞;激光共聚焦三维成像显示胶质细胞与微循环之间的关系。 结果:缺血同侧海马和缺血边缘区在GFAP阳性细胞增多的同时,局部微血管血流灌注明显减少,应用细胞周期抑制剂roscovitine抑制星型胶质细胞增生可以明显增加局部微血管的血流灌注。 结论:脑缺血后缺血边缘区和海马的反应性星型胶质细胞增生与微循环灌注减少密切相关,通过细胞周期调控可以抑制胶质增生改善局部微循环。