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目的 将在建立Nano-Co诱导的肝细胞L02损伤模型的基础上观察细胞的毒性损伤效应,以此探究Nano-co刺激对肝细胞NLRP3分子的激活作用,初步探讨NanoCo通过线粒体ROS诱导NLRP3分子激活的相关机制。这将进一步丰富和完善人们对纳米材料具有潜在健康危害的认识,对于研究Nano-Co的毒理学作用机制及针对NLRP3的潜在治疗前景提供理论依据。方法 1.应用透射电镜观察肝细胞L02对Nano-Co的摄取。2.将肝细胞L02暴露在不同剂量的Nano-Co中来建立肝细胞的损伤模型。通过CCK-8、LDH试剂盒检测的方法观察Nano-Co刺激产生细胞毒性效应。3.采用Western blot法检测Nano-Co刺激后细胞NLRP3激活、ASC和Caspase-1p20的表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Nano-Co刺激后细胞IL-1β和IL-18的释放水平。4.调控NLRP3的表达对Caspase-1 p20,IL-1β和IL-18表达的影响:用RNA干扰技术调控NLRP3的表达,采用Western blot法检测细胞Caspase-1 p20表达,ELISA试剂盒检测细胞IL-1β和IL-18表达水平。5.应用ROS,线粒体ROS检测试剂盒检测Nano-Co刺激后胞内ROS和mtROS的生成量。6.验证mtROS在Nano-Co诱发肝细胞NLRP3分子激活过程中的调节作用:利用总ROS清除剂NAC和mtROS特异性清除剂Mito-TEMPO(TEMPO)分别预处理细胞,再用Nano-Co刺激细胞,采取空白对照方式,用Western blot法检测细胞Caspase-1 p20等分子表达。通过ELISA法检测细胞上清液中IL-1β和IL-18的表达水平。7.调控NF-κB的表达对Caspase-1 p20,IL-1β和IL-18表达的影响:用NF-κB抑制剂预处理后再进行Nano-Co暴露细胞,采用Western blot法检测细胞Caspase-1 p20表达,ELISA试剂盒检测细胞IL-1β和IL-18表达水平。结果 1.透射电镜下观察到L02细胞摄取、内吞纳米钴颗粒并出现细胞超微结构变化。2.与对照组相比,不同剂量的Nano-Co刺激组的细胞存活率下降,LDH的释放量增多。且存在着时间与剂量的依赖性,表明Nano-Co对L02细胞具有细胞毒性效应。3.不同浓度Nano-Co暴露诱导L02细胞24 h后,Western blot结果显示:NLRP3的蛋白表达随着Nano-Co的浓度升高而增加,而pro-caspase-1(ProCasp1)、pro-IL-1β和ASC表达均无明显差异(P>0.05)。Nano-Co暴露可促进L02细胞内Casp1(20-kDa)和成熟的IL-1β(17-kDa)的蛋白表达,且7.5μg/mL的Nano-Co刺激细胞后,可明显使NLRP3炎症小体的活化蛋白Casp1(20-kDa)和IL-1β(17-kDa)升高(P<0.05)。ELISA检测结果显示在7.5μg/mL组和10μg/mL Nano-Co刺激组细胞中IL-18和IL-1β表达水平明显升高(P<0.01)。在转染siRNA NLRP3成功抑制NLRP3表达后,结果显示:NanoCo暴露的L02细胞中LDH释放量减少,且有效地抑制Casp1(20-kDa)和IL-1β(17-kDa)分子表达(P<0.01)。4.不同浓度Nano-Co处理L02细胞后,结果显示:ROS和mtROS水平随NanoCo的浓度增加呈上升趋势。分别用NAC(ROS抑制剂)和TEMPO(mtROS抑制剂)预处理细胞后,western blot结果显示:TEMPO组和NAC组均显著下调Casp1(20-kDa)和IL-1β(17-kDa)相关因子表达(P<0.01)。5.用BAY11-7082(NF-κB抑制剂)预处理肝细胞后,再暴露于Nano-Co。Western blot结果显示:不同浓度刺激组NF-κB在肝细胞中的表达量呈浓度依赖性增加,在NAC抑制组中P65表达被显著抑制(P<0.01)。而NF-κB抑制组明显地抑制Casp p20分子的表达(P<0.05),ELISA结果显示IL-1β、IL-18分子的表达量无明显变化。结论 1.Nano-Co通过诱导细胞发生氧化应激,引起ROS、mtROS生成增加,继而促使L02肝细胞内NLRP3炎性体的激活。2.氧化应激损伤、NLRP3可能是Nano-Co致肝损伤的治疗靶点,为Nano-Co细胞毒性的预防和治疗提供依据。