背景：分化抑制因子，又称DNA结合抑制因子(Inhibitors of differentiation/DNAbinding，Id)属于螺旋-环-螺旋(HLH)转录因子家族成员之一，对碱性HLH(bHLH)转录因子活性起负调节作用。哺乳动物细胞含四种Id分子(Id1～Id4)。Id3，作为血清诱导的立即早期基因第一次在小鼠成纤维细胞系中被发现，自1990年发现Id分子以来，有关该分子在细胞增殖和分化、肿瘤发生等方面的作用和意义，已进行了较广泛的研究。Id1过度表达可以促进细胞增殖，延迟细胞老化或导致细胞永生化。但有关Id家族的其他成员在细胞周期调控中的作用及其在不同病理和疾病状态下表达情况和作用还缺乏深入研究，某些研究尚未取得一致性结论。Id3是由119个氨基酸组成、分子量约13000的活性蛋白。Id3分子具有与Id1不同的细胞表达模式和调控机制。为进一步探讨Id3蛋白的生物学功能和拓展Id3在医学基础及临床应用上的研究范围，我们在表达和纯化重组人Id3蛋白的基础上，研制出抗人Id3的特异性抗体并建立了检测人Id3的双抗体夹心ELISA技术。　　 目的：在原核系统中表达并纯化人Id3重组蛋白，制备抗人Id3多克隆和单克隆抗体，建立检测人Id3的双抗体夹心ELISA方法。　　 方法：将重组表达载体Id3/pET32a转化大肠杆菌BL21(DE3)，以IPTG诱导重组蛋白的表达并经Ni2+亲合层析纯化，通过SDS-PAGE及western blot鉴定纯化目的蛋白。用纯化的Id3重组蛋白免疫家兔，制备多克隆抗体。通过多肽亲合层析去除多克隆抗体的非特异性反应成分，免疫细胞化学染色、免疫双向扩散及间接ELISA检测抗体特异性和效价。辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗人Id3多克隆抗体，采用棋盘滴定法确定夹心ELISA的包被抗体和酶标抗体的工作浓度，以系列稀释的Id3重组蛋白为标准抗原制定标准曲线，建立定量检测人Id3抗原的夹心ELISA法。　　 以纯化的人Id3重组蛋白为免疫原，免疫BALB/c小鼠。通过间接ELISA法检测免疫小鼠血清效价，选取血清效价高的小鼠用于单克隆抗体的制备。无菌分离免疫小鼠脾脏，制成单个细胞悬液，与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合。通过间接ELISA法筛选出8株阳性融合孔中的融合细胞，采用有限稀释法进行克隆与亚克隆培养：间接ELISA法筛选可特异性分泌抗Id3单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞；增量培养法制备单克隆抗体；Ig亚类鉴定试剂盒鉴定McAb的Ig类与亚类；间接ELISA法检测杂交瘤细胞冻融前后产生McAbs的效价；Western blot鉴定McAbs的特异性。　　 结果：用Ni2+亲合层析柱纯化Id3重组蛋白。制备兔(小鼠)抗人Id3多(单)克隆抗体。免疫细胞化学染色显示，制备的兔抗血清能与人Id3蛋白特异性结合。所得兔抗血清效价分别为1:8(双向扩散)和1:8000(ELISA)。单抗制备经克隆及3～4轮亚克隆，最终获得2株可稳定分泌抗Id3 McAb的杂交瘤细胞，分别命名为6G7和6G9；其分泌的McAb均为IgG1。Western blot分析表明，McAb6G7和6G9可与转印至膜上的人Id3重组蛋白形成强阳性条带。间接ELISA法检测两株细胞冻融前后所产生的McAb6G7、609的效价均分别为1：1000、1:5000。双抗体夹心ELISA法的包被抗体和酶标抗体的工作浓度分别为5μg/ml和1:4000。夹心ELISA的标准曲线为Y=0.0793+0.0188X，r=0.997。该方法检测线性范围为2～64u/ml，平均回收率为98.2％，批内变异系数为4.38％，批间变异系数为7.19％，该方法可用于人血清和体液中Id3的检测。　　 结论：人Id3多(单)克隆抗体的制备及夹心ELISA法的建立为今后研究Id3蛋白的功能及其在临床和基础医学中的应用奠定了基础。