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研究背景:乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)感染是导致严重肝脏疾病的主要原因之一。目前,全球约有HBV慢性感染者2.57亿人,HCV慢性感染者7100万人,对公共健康造成严重的负担。目前,乙肝的治疗药物主要有干扰素和核苷类似物两种,干扰素治疗应答率低,而核苷类药物治疗易复发。丙肝治疗的传统方法为长效干扰素联合利巴韦林,但毒副作用大,且对HCV基因Ⅰ型病毒应答率低。近年,靶向HCV蛋白酶和聚合酶的直接抗病毒药物(Direct-actingAntivirals,DAAs)的飞速发展极大的提高了抗病毒应答率,但是一些不足之处也逐渐显现,如在HBV/HCV共感染的患者中,DAAs药物易造成HBV的复发,加之DAAs药物价格昂贵,因此,寻找新的抗病毒策略,尤其是能同时抵抗HCV和HBV两种病毒的广谱抗病毒策略,仍然是非常有必要的。保持自身的代谢和激发免疫应答是宿主细胞在受到外界刺激,如病毒感染时,维持内稳态的两个方面。microRNAs在调节宿主代谢和免疫应答中均起着极为重要的作用。有研究显示,在HCV及HBV感染的病人肝组织及体外细胞培养模型中,miR-130a的表达发生明显的改变;同时有研究显示,miR-130a表达的改变对HCV及HBV的复制具有调节作用。我们在研究中发现miR-130a能调节Ⅰ型干扰素及其下游干扰素刺激基因的表达,同时miR-130a靶作用于丙酮酸激酶PKLR,调节PKLR的表达及其催化的丙酮酸生成反应。但是针对miR-130a调节HCV和HBV的复制及宿主免疫是否与丙酮酸代谢存在关联,目前尚不清楚。研究目的:1、探索miR-130a对HCV和HBV复制的影响;2、鉴定miR-130a作用的靶基因;3、阐述miR-130a调控HCV和HBV复制的分子机制。研究内容:第一部分miR-130a通过调节Ⅰ型干扰素信号通路调控HCV复制的研究;第二部分miR-130a与维生素D协同抗HCV作用研究;第三部分miR-130a通过调节靶基因PKLR的表达调控HCV和HBV复制的研究;第四部分PKLR及丙酮酸调控HCV和HBV复制的研究。研究方法:1、将miR-130a模拟物(mimic)转染HCV复制子细胞(Con1b细胞)及JFH1感染的Huh7.5.1细胞(JFH1细胞),使miR-130a高表达,检测miR-130a高表达对内源性IFNα/β生成、干扰素刺激基因(ISGs)表达及HCVRNA复制的影响;在干扰素受体缺陷的细胞U5A中及其母细胞2fTGH中转染miR-130a模拟物,检测两种细胞中,ISGs的表达,明确miR-130a对ISGs表达的影响是否依赖于干扰素与其受体的结合。2.在Con1b及JFH1感染的Huh7.5.1细胞中,加入骨化三醇(Calcitriol,VD的活性形式)处理、转染miR-130a模拟物或转染miR-130a模拟物的同时加入骨化三醇处理,检测骨化三醇、miR-130a对HCV复制、IFNα/β表达的影响,并检测二者是否具有协同作用。3、采用四种预测软件(TargetScan、miRanda、RNAhybrid 及 PITA)对 miR-130a 可能发挥作用的靶基因进行预测,通过双荧光素酶报告基因实验对可能作用的三个靶基因(IL18BP、PKLR及LDLR)进行验证。在HCV复制子细胞OR6、JFH1感染的Huh7.5.1、JFH1感染的人原代肝细胞(PHHs)中或者HBV细胞系HepAD38、HBV 感染的 pNTCP-PHHs、HBV 感染的 pNTCP-Huh7.5.1 细胞中,转染 miR-130a模拟物(mimic)或者 miR-130a表达抑制物(inhibitor)或者 CRISPR/Cas/9gRNA,考察miR-130a过表达、抑制或基因沉默对HCV RNA复制、HBV DNA复制及对PKLR表达的影响。4、靶基因功能研究,通过构建PKLR过表达质粒,将质粒转染细胞进行过表达或者通过小分子干扰RNA(siRNA)或CRISPR/Cas9技术使其沉默,检测PKLR过表达及沉默对HCV及HBV复制的影响。同时考察PKLR催化反应产物丙酮酸对HCV、HBV复制的影响,以及补充丙酮酸是否对miR-130a高表达及PKLR沉默引起的病毒复制的抑制具有营救效果。研究结果:1、JFH1感染的Huh7.5.1及HCV复制子细胞Con1b中,miR-130a过表达后,HCV RNA复制显著降低,Ⅰ型干扰素(IFNα/β)及一些ISGs基因(Mx1,CH25H)的表达显著增加,但miR-130a的表达不受IFNα刺激的影响。此外,在干扰素受体IFNAR2c缺失的U5A细胞中,miR-130a高表达对ISGs基因无上调作用,提示miR-130a对ISGs的调节是通过干扰素信号通路实现的。2、骨化三醇不影响miR-130a的表达;miR-130a过表达及骨化三醇均显著抑制HCV RNA复制,两者具有一定的叠加作用。miR-130a过表达及骨化三醇均显著促进IFNα/β的表达,但在miR-130a过表达的同时加入骨化三醇,IFNα/β的表达低于单独处理组。miR-130a过表达及骨化三醇均显著抑制HCV入胞受体LDLR的表达及HCV的入胞吸附过程,且同时处理具有一定的叠加作用。这些结果提示,miR-130a过表达与骨化三醇的抗病毒叠加效应与Ⅰ型干扰素信号通路无关,很可能是通过调节病毒的吸附入胞实现的。3、通过四种不同的软件对miR-130a可能作用的靶基因进行预测,我们获得2152个潜在的靶基因,其中有534个基因同时由2种以上的软件获得;通过文献检索的方法,我们从中筛选了 116个与病毒感染及肝脏疾病相关的基因进行研究,通过荧光定量PCR的方法,我们发现,在miR-130a高表达的细胞中,PKLR(编码丙酮酸激酶,广泛存在于肝脏及红细胞中),IL18BP(编码白介素18结合蛋白),LDLR(编码低密度脂蛋白受体)三个基因的表达显著降低。对这三个基因,我们进行了双荧光素酶报告基因实验,结果证实PKLR为miR-130a的靶基因,而IL18BP和LDLR不是。miR-130a高表达显著抑制PKLR的表达和HCV、HBV的复制;miR-130a表达抑制或基因沉默显著促进PKLR的表达及HCV和HBV的复制。4、PKLR过表达显著促进HCV及HBV的复制;PKLR基因沉默显著抑制HCV及HBV的复制。无丙酮酸培养基中培养的细胞,当向培养基中加入丙酮酸溶液后,HCV及HBV的复制显著增加,且在miR-130a过表达及PKLR沉默的实验组中加入丙酮酸,丙酮酸对miR-130a高表达及PKLR沉默导致的HCV、HBV复制的抑制具有营救作用。但是PKLR及丙酮酸处理均不影响miR-130a的表达,提示PKLR及丙酮酸位于miR-130a调节通路的下游。研究结论:1、miR-130a过表达显著抑制HCV及HBV的复制;而miR-130a表达抑制或基因沉默显著促进HCV及HBV的复制。miR-130a高表达与骨化三醇对HCV复制的抑制具有叠加效应。2、miR-130a过表达上调IFNα/β的表达,通过与细胞表面的干扰素受体结合,激活下游ISRE及ISGs的表达。但miR-130a与骨化三醇的抗病毒叠加作用与Ⅰ型干扰素信号通路无关。3、PKLR为miR-130a直接作用的靶基因,miR-130a通过调节PKLR的表达,影响其催化的丙酮酸生成过程,进而影响HCV和HBV的复制。4、miR-130a对Ⅰ型干扰素通路的调控与PKLR的表达及丙酮酸生成无显著的关联。