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研究背景:糖尿病肾病(Diabetic kidney disease,DKD)是最常见的糖尿病微血管并发症,其患病率逐年升高,已成为终末期肾病的首要病因。越来越多证据显示DKD显著增加糖尿病患者的心血管事件发生率以及全因死亡率,严重损害患者健康,给社会带来沉重负担。肾小球内皮细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分,其损伤在DKD中具有关键作用,但其损伤机制不完全清楚。中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophil extracellular traps,NETs)是中性粒细胞在受到刺激后释放的以DNA为骨架,粘附髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)、中性粒细胞弹性蛋白酶(Neutrophil elastase,NE)等多种蛋白颗粒的网状物质。肽酰基精氨酸脱亚氨酶4(Peptidylarginine deiminase 4,PAD4)是形成NETs的关键酶。NETs主要在机体的感染部位产生,能捕获并杀死病原体,快速控制感染,起抗菌作用。近来有研究报道NETs具有除杀死病原体的作用外,其也参与了系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病及动脉粥样硬化等炎症性疾病。有研究发现糖尿病患者循环中NETs水平显著升高,课题组前期研究发现DKD患者循环中的NETs标志物游离DNA水平与肾病进展相关,提示NETs可能参与DKD的发病,但其作用和机制尚不清楚。研究目的:本研究旨在探讨NETs在DKD发病中的作用和机制。研究方法:相关关系(人群研究):纳入70名不伴DKD的糖尿病患者(非DKD患者)以及70名DKD患者。ELISA检测患者血清中的NETs水平(MPO-DNA),免疫荧光检测患者肾脏组织中NETs的水平以及定位(MPO、NE)。因果关系(动物模型):利用小剂量链脲佐菌素构建野生型及NETs缺陷型(PAD4-/-)的糖尿病小鼠动物模型。收集小鼠的血液、尿液及肾脏组织,检测肾功能、NETs水平以及肾脏损伤的变化。机制研究:(1)高糖干预人中性粒细胞,检测NETs的形成;蛋白质质谱检测高糖或佛波醇(NETs的经典诱导剂)诱导的NETs的蛋白质组分。(2)NETs干预人肾小球内皮细胞,通过转录组学测序、扫描电镜、细胞流式分析、白蛋白滤过实验、免疫荧光染色、实时定量聚合酶链反应(Quantitative real-time PCR,q PCR)以及蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)检测肾小球内皮细胞损伤指标的变化。研究结果:相关关系(人群研究):DKD患者循环中的NETs标志物MPO-DNA水平显著高于非DKD患者。MPO-DNA水平与尿白蛋白/肌酐比值(Urine albumin-creatinine ratio,UACR)呈正相关关系。免疫荧光染色显示NETs在DKD患者的肾脏中沉积增多,主要定位于肾小球,且靠近肾小球内皮细胞。肾小球中沉积的NETs水平与内皮细胞CD31的表达呈负相关关系。因果关系(动物模型):NETs在糖尿病小鼠血清及肾脏中含量升高,并且在肾小球中沉积。PAD4-/-阻断NETs形成后显著降低了糖尿病小鼠的UACR,缓解了肾小球的增大、系膜扩张,以及肾小球内皮细胞和足细胞的损伤。机制研究:(1)高糖诱导中性粒细胞形成NETs的作用主要通过活性氧依赖途径;高糖与佛波醇诱导的NETs的蛋白质组分存在显著差异。(2)高糖诱导的NETs干预人肾小球内皮细胞:a.CCK-8结果显示NETs对肾小球内皮细胞呈剂量依赖的毒性作用;b.NETs损伤肾小球内皮细胞,内皮细胞间连接蛋白(VE-cadherin、CD31)表达显著降低,内皮细胞损伤标志物(VCAM-1、ET1)表达显著升高,白蛋白滤过增加;c.转录组学测序显示NETs主要改变了细胞膜蛋白相关基因及细胞膜电荷相关基因的表达;d.扫描电镜结果显示NETs使肾小球内皮细胞细胞膜出现球形凸起及孔洞的细胞焦亡样改变;e.流式细胞结果显示NETs可以诱导内皮细胞死亡;f.WB、q PCR结果提示NETs增加细胞焦亡相关蛋白的表达;g.干预细胞表面电荷(油胺增加细胞表面电荷)可减少NETs诱导的内皮细胞焦亡。研究结论:NETs通过电荷作用促进肾小球内皮细胞焦亡参与DKD的发病。