雪旺样细胞诱导分化过程中Neuregulin-1/ErbB通路与Sox10关系的研究

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目的:本实验利用干细胞具有多向分化潜能的特征,采用体外诱导骨髓间充质干细胞分化雪旺氏样细胞,并在基础上探讨分化过程中Neuregulin-1/ErbB信号通路对于Sox10表达的影响及意义。  方法:用高糖培养基分离小鼠BMSCs后进行原代培养,当细胞达到30%融合时,用加入1mMβ-巯基乙醇的DMEM培养细胞24h,接着用加入了10%胎牛血清和35ng/mL全反式维甲酸(RA)的DMEM培养细胞72h,细胞分化前处理结束。实验将实验组分为了三组进行了诱导。诱导剂组:采用经典的诱导方法,用加入了10%FBS、5ng/mL血小板衍生因子(PDGF-AA)、10ng/mL碱性成纤维生长因子(bFGF)、14mM Forskolin和200ng/mL Heregulin的DMEM培养细胞。阻断剂组(TAK-165组):用加入了10%FBS、5ng/mL血小板衍生因子(PDGF-AA)、10ng/mL碱性成纤维生长因子(bFGF)、14mM Forskolin、50μM TAK-165(ErbB2阻断剂)和200ng/mL Heregulin的DMEM培养细胞,从而阻断Neuregulin-1/ErbB通路。HRG off组:用加入了10%FBS、5ng/mL血小板衍生因子(PDGF-AA)、10ng/mL碱性成纤维生长因子(bFGF)、14mM Forskolin的DMEM培养细胞。通过实时荧光定量PCR检测S100、p75、GFAP、Sox10、neuregulin1、ErbB2和ErbB3的表达变化;运用免疫荧光染色法测得雪旺细胞标记物S100、p75、GFAP,用以检测干细胞分化为雪旺样细胞的程度;CCK-8检测各组细胞诱导过程中的增殖能力。  结果:免疫荧光染色检测结果显示诱导组和阻断剂组的细胞胞浆中可见S100、p75、GFAP的阳性表达,PCR结果显示,阻断剂组S100,p75,GFAP表达均显著低于诱导组,差异有显著性(P<0.05);实时荧光定量PCR结果显示在诱导的0d、1d、4d、7d后Neuregulin-1的表达持续且稳定,各时间点表达无显著差异(P>0.05),在HRG off组与阻断剂组Neuregulin-1表达也并未受到显著影响(P>0.05),说明Neuregulin-1参与了诱导分化的全过程;实时荧光定量PCR结果显示ErbB2一直都有持续稳定的高表达,在分化0d、1d、4d、7d时的表达并无显著变化(P>0.05),而ErbB3在诱导初期并不产生,而随着诱导时间的延长表达量逐渐上升,说明Neuregulin-1/ErbB3信号通路在分化过程中的作用逐渐增强;在体外诱导过程的过程中,Sox10也有稳定的表达。运用实时荧光定量PCR与PCR凝胶检测Sox10在分化0d、1d、4d、7d时的表达,且无显著差异(P>0.05),可见其在分化过程中持续稳定的表达;与诱导剂组相比,阻断剂组中Sox10的表达呈现明显的下降,,差异有显著性(P<0.05),而HRG off组中的Sox10无明显下降(P>0.05),说明Neuregulin-1/ErbB信号通路维持或者是促进了Sox10的表达;在三组细胞中,增殖能力最强的的是分化程度最低的HRG off组,其次为诱导剂组,TAK165组增殖能力最低,差异有显著性(P<0.05)。  结论:1.Neurogulin-1/ErbB2信号通路对于小鼠BMSCs向雪旺氏样细胞的分化过程有促进作用,其机制可能与促进细胞增殖有关。  2.证明了Neuregulin-1/ErbB信号通路对于Sox10表达重要促进与维持作用,而这一作用可能进一步影响了骨髓间充质干细胞分化为雪旺样细胞的过程。
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