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研究背景 神经干细胞(Neural Stem Cells，NSCs)移植修复神经系统损伤是目前神经医学领域的一个研究热点，但是由于既往从胎脑组织获得NSCs的方法面临细胞数量不足以及伦理学束缚等困难，在临床应用受到限制。骨髓基质细胞多分化潜能的发现和向神经细胞方向定向分化的成功，为神经干细胞的来源增加了一个新的途径。 骨髓基质细胞(Bone Marrow Stromal cells，BMSCs)是骨髓细胞中除去造血干细胞(非粘附细胞)之外的细胞部分(粘附细胞)，又称为塑料粘附细胞(plastic-adherent cells)、克隆形成单位成纤维细胞(clone-forming-unit fibroblast cells)或间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。目前研究发现哺乳动物BMSCs可以向多种组织细胞分化，特别是可以分化出来源于外胚层的组织如神经组织，可以将BMSCs诱导成为神经干细胞(NSCs)。由于它可直接从自体骨髓腔抽取或从松质骨获得，来源充足，取材方便，创伤小，自体移植后不受免疫排斥反应及伦理道德的约束，细胞处于未分化状态，增殖能力强，可在体外大量培养扩增，由此获得的神经干细胞称之为“骨髓源性神经干细胞”，因此BMSCs可以作为一种理想的种子细胞。 本实验旨在培养出“骨髓源性神经干细胞”，然后进行脑内移植，观察细胞在脑内存活、迁移等情况。本实验以灵长类动物食蟹猴为实验对象，进行神经干细胞培养及移植实验，为骨髓源性神经干细胞自体移植在临床的开展和应用提供依据。 第一部分:骨髓基质细胞体外培养获得神经干细胞的实验研究目的: l、观察骨髓基质细胞在体外培养及诱导分化获得神经干细胞的可行性; 2、摸索并确立骨髓基质细胞诱导为神经干细胞的适当培养方法及条件，建立一个获得“骨髓源神经干细胞”的成熟技术平台，为其在组织工程学研究和临床医学中的广泛应用奠定基础。方法: 1、以大鼠(预实验)和食蟹猴为实验对象，无菌穿刺实验动物骨髓腔抽取骨髓，梯度密度离心获得有核细胞，粘附法提取骨髓基质细胞。 2、提取的骨髓基质细胞悬液加入神经干细胞培养液，调整细胞浓度到106个/m1后，接种于多孔培养板中，加胎牛血清(l%终浓度)及LIF(1Ong/ml)+b FGF(10ng/ml)，在37oC、5%COZ、饱和湿度条件下培养，48小时后换液以去除非粘附细胞，以后每周换液2次。培养1一2周后得到较纯化的BMSCs，可进行细胞传代培养，在培养过程中加入胎牛血清以及RA(终浓度0.5 u g/ml)以诱导BMSCs向神经干细胞分化。 3、观察培养细胞:CKZ型倒置相差光学显微镜(OLYMPAs，JA孙创)追踪观察细胞生长情况并拍照;采用SABC法进行免疫细胞化学检测(一抗分别为鼠抗一estin、兔抗双SE、鼠抗一GEAP，二抗试剂盒为生物素化羊抗小鼠IgG/羊抗兔IgG，链霉亲和素一生物素一过氧化酶复合物)，不同阶段培养细胞经4%多聚甲醛固定，0.olmo比PBS冲洗，一抗37℃60min;生物素化二抗室温孵育10 min;链霉亲和素一生物素一过氧化酶复合物室温孵育10 min;DAB显色染色5~15min，着棕色的细胞为阳性，OLYMPAS光学显微镜观察拍照。结果: 1、贴壁细胞培养48h后有分裂增殖，然后逐渐形成岛屿状细胞克隆团，给予适当的分化条件10一20d后，这些细胞能分化成具有细长突起、多种形态的细胞。 2、经免疫细胞化学鉴定，早期的培养细胞在没有给予诱导分化时可阳性表达Nestin，表明具有干细胞特性;培养细胞经诱导分化后有G队P、NSE阳性表达的细胞出现，并随着诱导时间的延长，GEAP、NSE阳性表达的细胞逐渐增多。结论: 1、哺乳动物骨髓的BMSCs在合适的体外培养条件下能够转化为神经干细胞，保持增殖分化能力，灵长类动物BMSCs具有同样的特性; 2、目前我实验室采用的培养方案(神经干细胞培养基)适合于食蟹猴骨髓基质细胞向神经干细胞转化; 3、源自BMSCs的神经干细胞能分化出具有神经系细胞特征的细胞; 4、来源于自体骨髓、培养、诱导获得的具有神经干细胞特征的细胞来源充足，没有伦理学和免疫排斥的问题，可用于脑内移植实验研究。 第二部分:骨做源神经干细胞自体移植修复脑皮层损伤的实验研究目的: l、建立脑皮层损伤动物模型后，将源自自体骨髓基质细胞的“骨髓源性神经干细胞”移植到模型动物脑内，观察其增殖、生长和迁移等情况; 2、通过采用伤后即时移植和延迟移植“骨髓源神经干细胞”的方法，观察骨髓源性神经干细胞在创伤不同时期在创伤灶的生长、存活情况。方法: 1、立体定向辅助下，在实验动物脑皮层的同一部位制作8 X 8 x4~皮层创伤灶; 2、在细胞培养室超净台内将已行BrdU标记的骨髓源性神经干细胞收集、离心，制成干细胞悬液，约0.4一0.sml，细胞数量级大于1010个。 3、将在体外培养、诱导并且标记有B川U的骨髓源性神经干细胞悬液采用立体定向多点注射法移植到皮层创伤灶及其周围脑组织中; 4、在l、3、6个月分别灌杀动物，取脑固定、切片，SABC法检测，观察各实验组和对照组动物BrdU阳性细胞的生长、迁移情况。 5、