论文部分内容阅读
目的：观察清热活血方对胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠关节滑膜血管新生的影响,及体外对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)和脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移、黏附和管腔形成的影响,并通过PI3K/Akt通路探索相关作用机制,为清热活血方在临床治疗类风湿关节炎提供实验依据。方法：将健康雌性SD大鼠称重后随机分为6组：正常组,模型组,清热活血方低、中、高组(15、20、25g生药/kg),抑制剂Ⅰ.Y294002组(20mg/kg),采用Ⅱ型胶原乳化剂在大鼠尾根部皮下注射,在第7天于相同部位注射等量Ⅱ型胶原乳化剂以加强免疫,建立CIA模型。免疫第10天开始灌胃给药,正常组和模型组予等量生理盐水。连续给药28天,并在过程中观察并记录各组大鼠体重变化、关节症状和肿胀度；各组大鼠腹主动脉取血于离心管,离心收集血清,用ELISA法测定各组大鼠血清中促炎症因子白介素-1β (IL-1β)和促血管新生血管生长因子(VEGF)的表达；Western Blot法检测踝关节组织中PI3K/Akt信号转导通路相关蛋白PI3K、p-Akt、PTEN的表达；Real-time PCR检测滑膜组织中胎盘生长因子(PLGF)及其受体Flt1、Flk1和PI3K/Akt通路负调控基因PTEN的mRNA水平表达。取RA患者膝关节滑膜组织,采用组织贴壁法分离人类原代RA-FLS,传代培养,第3-6代细胞用于实验；同时培养HUVEC进行实验。清热活血方低、中、高浓度(20、100、500ng生药/mL)与TNF-a诱导的RA-FLS和VEGF165诱导的HUVEC共孵育,并设置空白对照组,采用MTS法检测细胞增殖活性；通过划痕实验观察细胞的迁移作用；用细胞外基质的主要成分之一纤连蛋白(FN)包被培养板,观察细胞对FN黏附的变化；采用基质胶包被培养板,观察HUVEC的管腔形成能力；ELISA法测定RA-FLS分泌的IL-1β、VEGF、PLGF及其受体Flt1、Flk1的表达；Western Blot检测PI3K/Akt通路相关蛋白水平的表达。结果：1.清热活血方对CIA大鼠关节炎症状、关节肿胀度和体重的影响模型组与正常组相比,大鼠关节红肿明显,后足肿胀度显著增加(P<0.001),与模型组相比,清热活血方可呈剂量依赖性减轻关节红肿的症状,且中、高剂量(20、25g/kg)可显著降低关节肿胀度(P<0.05), LY294002亦可明显缓解后足肿胀度(P<0.05)。与正常组相比,模型组体重增长缓慢,清热活血方与模型组相比,能呈剂量依赖性地促进CIA大鼠体重的增加,高剂量(25g/kg)组与LY294002组在免疫第21天起体重增加明显(P<0.05)。2.清热活血方对CIA大鼠血清IL-1β、VEGF表达的影响给药28天后,与正常组相比,模型组血清IL-1β、VEGF的含量显著升高(P<0.01),与模型组相比,清热活血方可不同程度地降低IL-1β、VEGF的含量,呈剂量相关性,高剂量(25g/kg)能明显降低IL-1β、VEGF的含量(P<0.05),LY294002组IL-1p明显下降(P<0.05)。3.清热活血方对CIA大鼠踝关节组织中PI3K/Akt通路蛋白表达的影响给药28天后,模型组相较正常组,组织中P13K蛋白表达和Akt磷酸化水平显著升高(P<0.001),清热活血方治疗后可呈剂量依赖性下调PI3K、p-Akt蛋白的表达(P<0.01,P<0.001)。模型组的PTEN蛋白表达较正常组显著下调(P<0.001),清热活血方中、高剂量(20、25g/kg)能明显上调PTEN的表达(P<0.05, P<0.001), LY294002能显著抑制PI3K、p-Akt并促进PTEN的表达(P<0.001)。4.清热活血方对CIA大鼠膝关节滑膜组织中PLGF、Flt1、Flk1及PTEN mRNA表达的影响给药28天后,模型组的PLGF、Flk1、Fit1mRNA的表达水平较正常组显著升高(P<0.01),与模型组相比,清热活血方20、25g/kg给药剂量处可明显下调表达水平(P<0.05,P<0.01)。与正常组相比,模型组PTENmRNA的表达显著降低(P<0.001),清热活血方25g/kg能显著升高PTEN mRNA表达(P<0.001)。LY294002均能显著下调PLGF、Flk1、Flt1,上调P TENmRNA水平的表达(P<0.01,P<0.001)。5.清热活血方对RA-FLS和HUVEC增殖活性的影响与空白对照组比较,TNF-a可明显提高RA-FLS的增殖活性(P<0.05),清热活血方可呈浓度依赖性抑制RA-FLS增殖,在25、12.5μg/mL有显著性差异(P<0.05),与空白对照组相比,VEGF诱导能明显促进HUVEC增殖(P<0.05),清热活血方可抑制HUVEC的增殖活性,在12.5μg/mL浓度处差异有显著性(P<0.05)。6.清热活血方对RA-FLS和HUVEC迁移的影响RA-FLS划痕后24h与Oh相比,空白对照组划痕区域可见少量细胞生长,TNF-a诱导促进RA-FLS迁移作用增强(P<0.001)；与TNF-a组比较,清热活血方能减弱显著RA-FLS向划痕区域迁移(P<0.01,P<0.001),并且呈现量效相关性。HUVEC划痕后24h与Oh相比,空白对照组有少量细胞向划痕区域迁移,VEGF诱导促进HUVEC迁移作用显著增强(P<0.001),清热活血方处理与VEGF组相比,可呈剂量依赖性抑制HUVEC向划痕区域迁移(P<0.001)。7.清热活血方对RA-FLS和HUVEC黏附的影响与1%BSA阴性对照相比,RA-FLS对FN有较强的黏附能力(P<0.001),TNF-α诱导可显著增加RA-FLS对FN的黏附(P<0.001)；清热活血方可呈剂量依赖地抑制其黏附能力(P<0.001)。HUVEC与阴性对照相比,对FN黏附能力较强(P<0.001),VEGF诱导能显著促进HUVEC对FN的黏附(P<0.001)；清热活血肪能抑制其黏附作用(P<0.001),并呈剂量相关性。8.清热活血方对HUVEC管腔形成的影响与空白对照组相比,VEGF诱导能明显促进HUVEC在基质胶上形成管腔的能力(P<0.001),清热活血方随浓度的增大可显著抑制HUVEC的管腔形成(P<0.05,P<0.001),并呈剂量依赖性。9.清热活血方对RA-FLS 和 HUVEC中血管新生相关因子含量的影响与空白对照组相比,TNF-a诱导可显著增加RA-FLS培养上清中IL-1β、VEGF.PLGF的含量(P<0.01),清热活血方5OOng/m L组可明显降低上清中IL-1p、PLGF勺含量(P<0.05),在100、500ng/mL浓度组能显著减少VEGF的含量(P<0.05,P<0.01)。VEGF诱导能显著促进HUVEC中V EGFR1、VEGFR2的含量增加(P<0.01),清热活血方100ng/mL可明显降低其含量(P<0.05)。10.清热活血方对RA-FLS和HUVEC中PI3K/A kt通路蛋白表达的影响与空白对照组相比,TNF-α可显著促进RA-FLS中 PI3K蛋白的表达和Akt的磷酸化(P<0.001),清热活血方能呈剂量依赖性降低P13K、p-Akt的表达(P<0.001),加入LY294002亦能显著抑制TNF-α诱导的RA-FLS中PI3K、p-Akt表达。同时,VEGF诱导相比于空白对照组,PI3K、p-Akt的蛋白表达明显升高,(P<0.001),清热活血方能不同程度地抑制其表达(P<0.001),LY294002亦可显著抑制VEGF诱导HUVEC中PI3K、p-Akt的蛋白表达水平升高。结论：1.清热活血方灌胃治疗可减轻CIA大鼠关节红肿症状,降低关节肿胀度,并能剂量依赖性地降低血清中促炎因子IL-1β和促血管新生因子VEGF的含量,下调滑膜组织中PLGF、Flt1、Flk1mRNA的表达水平,从而改善CIA大鼠临床症状、减轻滑膜炎症、抑制新生血管的形成,延缓关节炎的进展。2.清热活血方能显著抑制RA-FLS的增殖、迁移、黏附以及促炎因子IL-1β和促血管生长因子VEGF、PLGF的含量,与对HUVEC增殖、迁移、黏附、管腔形成及Flt1、Flk1含量的抑制协同作用,抑制血管新生的发生。3.清热活血方可呈剂量依赖地下调CIA大鼠及RA-FLS和HUVEC细胞中PI3K、p-Akt蛋白的表达,上调CIA大鼠负调控基因PTEN的蛋白和mRNA水平的表达,提示清热活血方可能通过PI3K/Akt通路调控细胞增殖、迁移、黏附等作用及血管新生相关因子的表达,抑制滑膜新血管的形成。