支气管哮喘(哮喘)是淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞等多种炎性细胞及细胞因子参与的一种慢性呼吸道炎症。随着免疫学及分子生物学研究的深入，越来越多的证据表明免疫功能紊乱在支气管哮喘发病机制中起着重要作用。尤其是T淋巴细胞功能紊乱。既往研究指出CD4+T淋巴细胞是哮喘的主要炎症细胞，导致Th1／Th2功能失衡，但近来对于T淋巴细胞的另-亚群-调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)紊乱导致的免疫耐受破坏在哮喘发病机制的地位越来越受到重视。CD4+CD25+调节性T细胞的数量或功能异常有可能导致哮喘的发生。 研究目的 本实验拟首先观察不同浓度氨茶碱对健康人外周血T淋巴细胞及CD4+T、CD8+T亚群和CD4+CD25+Treg自噬和凋亡的影响，得到可调节其自噬的最低浓度，接着通过观察小剂量氨茶碱和地塞米松对哮喘患者外周血CD4+T淋巴细胞和CD4+CD25+Treg细胞的自噬和凋亡的调节作用，以及对CD4+CD25+Treg表达Foxp3的影响。进一步了解小剂量氨茶碱对哮喘患者CD4+T淋巴细胞和CD4+CD25+Treg的免疫调节作用。为小剂量氨茶碱的临床应用提供了新的理论指导依据。 第一章：氨茶碱对健康人外周血T淋巴细胞及其亚群自噬的免疫调节作用茶碱类药物是目前治疗哮喘的常用药物，近年的研究表明在其血浆浓度尚未影响气道平滑肌张力时就发挥着免疫调节和抗炎的作用。而T淋巴细胞及其亚群通过自噬来达到免疫稳态。本实验拟通过观察不同浓度氨茶碱作用于体外培养的健康人T淋巴细胞及CD4+、CD8+T亚群和CD4+CD25+Treg自噬和凋亡的情况，分析小剂量氨茶碱对上述免疫细胞自噬的免疫调节作用。并得出可影响其自噬的最低氨茶碱浓度，为后续的实验提供小剂量氨茶碱的剂量依据。 1、方法 经密度梯度离心法、尼龙棉柱法和磁分离法分离所得的健康人T淋巴细胞及CD4+、CD8+T淋巴细胞和CD4+CD25+T调节细胞，分氨茶碱(不同浓度)、地塞米松(DXM)及空白(blank)组培养后观察细胞光镜及电镜形态学、MDC荧光染色，并用流式细胞仪检测自噬和凋亡细胞比例和CD4+CD25+T调节细胞的Foxp3表达情况。 2、结果 2.1流式细胞术检测健康人外周血T淋巴细胞及其亚群(CD4+、CD8+、CD4+CD25+T细胞)的纯度T淋巴细胞的纯度为81.3％～94。5％；CD4+T淋巴细胞的纯度为84.1％～90.4％；CD8+T淋巴细胞的纯度为56.5％～87.6％；CD4+CD25+T调节细胞的纯度为77.4％～92.3％。CD4+CD25+Treg占健康人外周血CD4+T淋巴细胞的比例4.12％～7.98％。 2.2氨茶碱对健康人外周血T淋巴细胞自噬的影响。 2.2.1氨茶碱对T淋巴细胞自噬的调节效应与氨茶碱浓度的关系经氨茶碱(10-8～10-3mol／L即0.0018～180μg／ml)作用于T淋巴细胞72h后，10-5～10-3mol／L氨茶碱(1.8～180μ g／ml)可诱导其自噬率增加：再予(2-7*10-4～20*10-4mol/L即0.14~18ug／mL)氨茶碱作用于T淋巴细胞72h后，2-4*10-4～20*10-4 mol／L氨茶碱(1.13～18ug／mL)可诱导其自噬率增加，从而确定2-4*10-4mol/L氨茶碱(1.13ug／mL)为可调节其自噬率增加的最小剂量。 2.2.2氨茶碱对T淋巴细胞自噬的调节与时间梯度、细胞数量的关系10-5 mol／L氨茶碱诱导T淋巴细胞(5×105／1.5ml／孔)Oh～72h后，自噬率随时间延长而增高：当T淋巴细胞数分别为1×106／1.5ml／孔、5×105／1.5ml／孔、2×105／1.5ml／孔时，有随T淋巴细胞密度的减少而自噬率增加趋势。 2.3小剂量氨茶碱(2-4*10-4mol／L即1.13ug／mL)对T淋巴细胞亚群自噬的免疫调节作用小剂量氨茶碱可以诱导健康人外周血CD4+、CD4+CD25+T淋巴细胞自噬率增加，p值均<0.05；而不能诱导CD8+T淋巴细胞自噬率增加，p>0.05。 2.4小剂量氨茶碱与DXM的作用比较在CD4+T细胞，小剂量氨茶碱和DXM对自噬和凋亡的调节作用无差异；在CD8+T细胞，DXM对自噬和凋亡的影响明显强于小剂量氨茶碱；在CD4+CD25+T细胞，对自噬而言，两者无差异，对凋亡而言，DXM作用明显强于小剂量氨茶碱，可见，在不同的细胞组成成分，氨茶碱和DxM的免疫调节作用并不一致，各有侧重。 2.5小剂量氨茶碱调节健康人T淋巴细胞及其亚群的自噬与凋亡之间无显著相关。 2.6小剂量氨茶碱和DXM均不能诱导健康人外周血CD4+CD25+T淋巴细胞Foxp3表达增加，p>0.05。 小结 1.小剂量氨茶碱(24宰104 mol／L即1.13ug．mL-1)可以诱导健康人外周血T淋巴细胞及CD4+、CD4+CD25+T亚群自噬率增加，显示小剂量氨茶碱的免疫调节作用可能部分通过上述作用来实现。 2.小剂量氨茶碱诱导上述免疫细胞的自噬与凋亡不相关。可以认为氨茶碱诱导T淋巴细胞程序性死亡的方式并非单一并且相互独立。 第二章：氨茶碱对哮喘病人外周血CD4+T细胞和CD4+CD25+T调节细胞自噬的调节作用CD4+T淋巴细胞和CD4+CD25+T调节细胞是机体免疫系统维持外周免疫稳态的重要调控者，维持其正常的水平和功能将有助于抑制哮喘的发生。我们希望通过研究小剂量氨茶碱和地塞米松对哮喘患者外周血CD4+T淋巴细胞CD4+CD25+调节性T细胞自噬和凋亡的调节作用和对CD4+CD25+T调节细胞表达Foxp3的影响，旨在进一步深入了解小剂量氨茶碱在支气管哮喘中的免疫调节作用，从而为哮喘防治找到新的方向。 1、方法 经密度梯度离心法、尼龙棉柱法、磁珠分离法分离出哮喘患者外周血CD4+T淋巴细胞和CD4+CD25+T调节细胞，分小剂量氨茶碱(low dose aminophylline)、地塞米松(DXM)及空白(blank)组培养72h后，用流式细胞仪检测自噬和凋亡细胞比例并Foxp3的表达强度。 2、结果 2.1哮喘患者CD4+T淋巴细胞和CD4+CD25+Treg的纯度检测哮喘患者CD4+T淋巴细胞纯度为78.2％～93.5％，哮喘患者CD4+CD25+T调节细胞的纯度为75.2％～93.8％，CD4+CD25+Treg占哮喘患者外周血CD4+T淋巴细胞的比例4.51％～8.68％，其比例与健康人相比，差异没有统计学意义。 2.2哮喘患者CD4+T淋巴细胞： 2.2.1与阴性对照组相比，小剂量氨茶碱(2-4*10-4mol／L即1.13ug／mL)可以诱导哮喘患者外周血CD4+T淋巴细胞自噬率和凋亡率增加，p值<0.05。 2.2.2与阴性对照组相比，DXM(10-5mol／L)不能诱导哮喘患者外周血CD4+T淋巴细胞自噬及凋亡增加，p值均>0.05。 2.2.3在调节哮喘患者CD4+T淋巴细胞自噬和凋亡方面，小剂量氨茶碱与DXM的作用没有显著差异。 2.2.4哮喘患者外周血CD4+T淋巴细胞的自噬率与凋亡率相关性分析2.2.5小剂量氨茶碱组、DXM组及正常对照组的自噬率与凋亡率间均未见明显相关性。 2.2.6小剂量氨茶碱组的自噬率和凋亡率在健康组和哮喘组中没有显著性差异。 2.3哮喘患者外周血CD4+CD25+T调节细胞： 2.3.1与阴性对照组相比，小剂量氨茶碱可以诱导哮喘患者外周血CD4+CD25+T调节细胞自噬率和凋亡率增加，p值均<0.05。 2.3.2与阴性对照组相比，DXM(10-5mol／L)可以诱导哮喘患者外周血CD4+CD25+T调节细胞自噬率和凋亡率增加，p值均<0.05。 2.3.3与DXM相比，小剂量氨茶碱在调节CD4+CD25+Treg自噬方面无差异，但在调节凋亡方面作用明显弱于地塞米松。 2.3.4哮喘患者外周血CD4+CD25+T调节细胞白噬率与凋亡率相关性分析2.3.5小剂量氨茶碱组和空白组的自噬率与凋亡率间呈负相关性(r值分别为-0.673和-0.633)：DXM组自噬率与凋亡率间未见相关。 小结 1.小剂量氨茶碱对哮喘患者外周血的CD4+T淋巴细胞、CD4+CD25+Treg均有免疫调节作用，均可诱导两者的自噬率和凋亡率增加。 2.小剂量氨茶碱诱导CD4+T细胞的自噬和凋亡之间没有相关性，而在CD4+CD25+Treg的自噬和凋亡间呈负相关(r=-0.673)，可以认为在不同的T细胞亚群中，小剂量氨茶碱对细胞自噬和凋亡的作用是有差异的，可以表现为相互独立或相互拮抗。 3.与DXM相比，小剂量氨茶碱在调节哮喘CD4+T细胞自噬和凋亡方面均没有显著差异；在调节CD4+CD25+Treg自噬方面也没有差异，但在调节凋亡方面作用明显弱于DXM。 全文结论 1.小剂量氨茶碱可以诱导外周血T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞和CD4+CD25+T调节细胞自噬率增加。 2.小剂量氨茶碱和DXM均不能诱导健康人及哮喘患者外周血CD4+CD25+T调节细胞Foxp3表达增加。