论文部分内容阅读
背景人脐带间充质干细胞(umbilicalcordmesenchymalstemcells,UC-MSCs)应用广泛,已深入到临床试验阶段。在用UC-MSCs进行移植治疗时会遇到很多问题,据文献报道和我们先前的实验研究发现,UC-MSCs经实验室培养扩增到临床输注环节众多,如分离培养前的组织采集、培养过程、移植前保存、运输等,这些环节都会对移植前细胞的质量产生不同程度的影响,而其中影响最直接和关键的是保存条件,特别是移植前细胞在移植媒介中存放的时间长短。在实际操作中并不能将新鲜分离的干细胞即刻输注入体内,如出现运输、手术等待等因素时均需将细胞在美国食品和药物管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)批准的保存介质中保存一定时间,目前临床移植常用的保存液生理盐水可使UC-MSCs活性下降,影响移植效果,但关于其活性下降原因的报道目前还很少。寻找致使临床移植保存液中UC-MSCs活性下降的原因,可针对性的为临床常用移植保存液的优化提供理论依据,也为UC-MSCs的最适移植保存介质的研究提供基础。目的1.建立稳定的脐带间充质干细胞培养体系,为后续实验的开展提供可靠的、稳定的细胞来源;2.探索氧化应激是否为UC-MSCs临床移植保存过程中活性下降的因素;并在保存液中添加自由基清除剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)后是否可提高保存效果而且不影响UC-MSCs的特性。方法1.根据脐带的结构和组成成分,选择胰蛋白酶、II型胶原酶、IV型胶原酶、透明质酸酶和DNAase五酶联合(以下简称五酶法)消化脐带组织分离培养UC-MSCs的方法来分离培养干细胞,对所获得的细胞按照现行国际认可的标准进行鉴定:①形态特征观察;②细胞表面标记;③多向分化潜能鉴定。2.室温(24℃)下用生理盐水保存UC-MSCs,0h、2h、4h、6h后分别检测细胞内活性氧水平、细胞裂解液中丙二醛含量以及三种常见抗氧化酶活性;在保存液中添加不同浓度的NAC,通过CCK-8法判断NAC的最适添加浓度。在保存液中添加最适NAC浓度后,通过检测细胞贴壁率变化来判断NAC对UC-MSCs活性的影响,从而判断NAC对细胞活性的改善情况。最后通过流式细胞术和诱导分化来鉴定NAC是否会影响干细胞特性。结果1.用五酶分离培养UC-MSCs的方法所获得的细胞符合MSCs鉴定标准;2.经生理盐水保存后UC-MSCs内活性氧水平升高;细胞裂解液丙二醛含量升高。抗氧化酶类:超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性均降低。添加NAC的移植保存液组较之不添加组保存UC-MSCs后细胞活性氧水平显著降低、贴壁率升高。保存液中添加NAC后,经保存的UC-MSCs经流式细胞术检测其表面标志分子符合干细胞特性,可诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论1.五酶联合消化法所获得的细胞符合MSCs鉴定标准,可为后续体内外实验提供稳定可靠的细胞来源;2.在临床常用移植保存液中UC-MSCs内活性氧升高是其活性下降的一个因素,在保存液中添加自由基清除剂NAC后能够一定程度的改善保存效果而不影响UC-MSCs的特性。