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研究目的:利用可转化n-6多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)为n-3多不饱和脂肪酸(n-3PUFAs)的fat-1转基因小鼠,研究体内n-3PUFAs的增加对小鼠体重和小鼠血液中外泌体mi RNA表达的影响,探讨n-3PUFAs通过外泌体的miRNA抑制肥胖的作用机制。研究方法:取健康的6周龄同窝小鼠,提取鼠尾中的DNA,通过PCR-琼脂糖凝胶电泳实验进行fat-1基因鉴定,判断其是否为fat-1转基因的小鼠。将鉴定好的小鼠分为四组:fat-1普通饮食(Normal Diet,ND)组、野生普通饮食组、fat-1高脂饮食组(High Fat Diet,HFD)和野生高脂饮食组,每组6只,进行8周的喂食。测量体长和体重,并且计算小鼠的Lee’s指数,判断高脂饮食喂养诱导的肥胖模型是否建立成功。模型建立成功后获取小鼠外周血,用超速离心法抽提血浆中的外泌体。电镜观察外泌体的表观情况;粒径技术检测外泌体颗粒大小;WB追踪鉴定外泌体。提取分离外泌体内的RNA,构建文库并进行mi RNA高通量测序。根据测序结果,运用生物信息学的方法,筛选差异表达的mi RNA,通过关联分析和KEGG富集分析差异表达mi RNAs调控的靶基因和相关联的信号通路,制作差异表达mi RNAs的火山图和相关联通路的散点图。选取差异表达程度较高的mi RNA,参考TargetScan、miRDB和miTarBase3个数据库分析,筛选出重要性、关联性更高的并且和肥胖与脂质代谢相关的靶基因和通路,制作mi RNA基因互作图,研究mi RNA-靶基因互作关系,探讨它们与肥胖的联系,并且通过荧光定量PCR的方法对相关靶基因进行验证。研究结果:成功建立小鼠肥胖模型,HFD组小鼠体重显著高于ND组小鼠,fat-1转基因小鼠体重相较于野生型显著降低(t=5.512,P<0.05);成功提取各组小鼠血液中的外泌体,并且鉴定外泌体成功,通过电子透射显微镜(TEM)观察到标准的茶杯状外泌体膜泡结构;粒径检测(NTA)得到符合标准的颗粒分布,样本颗粒直径集中在120nm左右;成功通过Western Blot实验追踪鉴定外泌体标志蛋白CD63。总RNA的含量和质量均满足测序要求,可用于高通量测序。对高通量测序的miRNA进行定量分析,不同小鼠组间的miRNA表达水平进行对比发现,差异表达显著(p<0.05且FC值≠1)的mi RNA有46个,其中高表达共29个,低表达17个。进行KEGG富集分析发现mi RNA及其靶基因与内吞(Endocytosis)通路相关,此通路与脂质代谢相关,外泌体通过质膜的作用形成囊泡输送物质。内吞通路上的靶基因共38个,相关的mi RNA共31个,较为复杂;进一步筛选后,在所有差异表达的mi RNA中,差异表达最为显著(p<0.001且FC值>1.5)miRNA共21个,进行通路分析后发现,它们与大量脂质代谢相关通路有密切联系,预测到其中6个重要miRNA(mmu-mi R-665-3p、mmu-miR-122-5p、mmu-miR-122-3p、mmu-mi R-194-5p、mmu-miR-34c-5p、mmu-miR-223-3p)落在脂肪酸代谢等通路的关键位置,差异表达程度高且经验证和脂质代谢相关联,此通路上对应的靶基因共9个(Fads1、Elovl2、Elov6、Hadha、Scad1、Scad2、Hsd17b12、Acot2、Acot4)。同时,6个预测的mi RNA在内吞通路上对应的靶基因12个(Arf6、H2-T-ps、Arrb1、Ist1、H2-T10、Wwp1、Snx4、IL2rb、Mvb12b、Rab11、fip3、Kif5a、Nedd4l)。这些靶基因和脂质代谢与肥胖有密切的关系。经qpcr验证,靶基因的表达与预测结果一致。研究结论:小鼠体内n-3 PUFAs的增加能够有效降低小鼠的体重,抑制肥胖。n-3 PUFAs能够调节血液中外泌体内miRNA的表达,其中具有显著差异性的mi RNA与肥胖有关,其相关的靶基因有效的集中在调控脂肪酸代谢等与脂质代谢相关的分子通路中,实验结果提示这可能是n-3 PUFAs降低体重抑制肥胖机制之一。另外也提示调控体内mi RNA的水平可能是未来预防/防治肥胖的潜在策略。